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PORTAL BIOQUÍMICA 04

 

Enzimas

 

Temas:

Enzimas são proteínas com atividade catalítica envolvidas em quase todas as reações químicas que mantém a homeostase animal. 

A natureza protéica torna as enzimas sensíveis à variação de pH e de temperatura. 

Cada enzima apresenta sua atividade máxima, em pH, temperatura e tempo específicos.

Propriedades Gerais

Devido ao seu papel na manutenção da vida, o estudo da regulação farmacológica das enzimas tem se tornado um elemento chave no diagnóstico clínico e na terapêutica.

As ribozimas constituem uma classe de catalisadores biológicos que, diferentemente das demais enzimas, não são moléculas protéicas. As ribozimas são moléculas de ácido ribonucléico (RNA) que catalisam reações de quebra das ligações fosfodiester de outras moléculas de RNA.

As enzimas estão presentes em todos os tecidos e fluidos do corpo. Enquanto as enzimas intracelulares participam do conjunto de reações das diversas vias metabólicas, as enzimas presentes na membrana plasmática regulam as reações no interior das células em resposta aos sinais extracelulares. No sistema circulatório estão presentes as enzimas responsáveis pela regulação do processo de coagulação sangüínea.

As enzimas, como todo catalisador, aceleram reações. Cada unidade da anidrase carbônica, por exemplo, é capaz de hidratar 105 moléculas de CO2 por segundo. Isso representa uma velocidade de hidratação 107 vezes mais rápida do que a reação não catalisada. A supremacia das enzimas sobre os demais catalisadores está, sobretudo, na sua especificidade tanto para as reações que catalisam quanto para os reagentes – substratos – envolvidos nas reações. O grau de especificidade não é o mesmo para todas as enzimas, por isso é que embora a grande maioria das enzimas estejam envolvidas com uma única reação química, existem enzimas que participam de um conjunto de reações intimamente relacionadas.

Tradicionalmente as enzimas recebiam um nome à proporção em que iam sendo caracterizadas. O aumento no número de enzimas isoladas e caracterizadas levou os pesquisadores a adotar uma nomenclatura e uma classificação sistemáticas. Atualmente as enzimas estão agrupadas em seis classes funcionais, de acordo com a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB).

As enzimas também são classificadas com base em sua composição, que podem ser simples ou conjugadas. Existem enzimas compostas apenas de proteínas, outras existem que apresentam moléculas orgânicas relativamente pequenas ligadas à proteína. Essas enzimas são denominadas holoenzimas, onde a parte protéica é conhecida como apoenzima e a porção não protéica, chamada de coenzima ou grupo prostético, pode ser simples como um íon metálico, ou complexo como pequenas moléculas orgânicas de natureza não protéica.

Coenzima é um composto orgânico, de baixo peso molecular e de natureza não protéica (quase sempre um nucleotídeo), que participa nas reações catalisadas por enzimas como aceitador ou doador de grupos químicos ou de elétrons.Considerando que a coenzima sofre alterações químicas, devido a ação da enzima a que está ligada, é comum considera-la como uma classe especial de substrato (ou segundo substrato). A coenzima, ao doar o grupamento químico para uma molécula aceitadora, é regenerada à sua forma original. Essa capacidade de regeneração da coenzima e, conseqüentemente, da holoenzima, justifica plenamente o conceito de enzima como um catalisador biológico.

As metaloenzimas trazem em sua composição um átomo de metal. Quando, no entanto, a enzima tem baixa afinidade por um íon metálico, mas depende dele para sua atividade, ela é considerada uma enzima ativada por metal.

 

Cinética

O crescimento e a manutenção das células nos seres vivos dependem da constante transformação de tipos diferentes de energia. Essas transformações são feitas por moléculas enzimáticas, participantes de sistemas biológicos altamente organizados. Sem a participação das enzimas nas células e organismos, a grande maioria das reações ocorreria de forma tão lenta que seria inviável a manutenção da vida. Uma reação catalisada por enzima pode se processar, a 25°C, 106 a 105 vezes mais rapidamente do que a mesma reação não catalisada.

A velocidade de uma reação química é definida pelo número de moléculas de reagente(s) que são convertidas em produto(s), em um período de tempo especificado e depende da concentração dos componentes químicos envolvidos no processo e das constantes de velocidade, que são características da reação. A grande maioria das reações que ocorrem na natureza é reversível. Cada reação química apresenta um ponto de equilíbrio característico, onde as velocidades absolutas na direção da formação de produto(s) e na direção de formação de reagente(s) são iguais. Este ponto de equilíbrio é descrito por uma constante de equilíbrio, que corresponde à relação entre as duas constantes de velocidade.

As enzimas, como outros catalisadores, não interferem na constante de equilíbrio das reações, mas aumentam a velocidade das reações químicas, diminuindo a energia de ativação dos reagentes, necessária para transforma-los em produto. Para que haja essa transformação, os reagentes precisam atingir um estado de transição e as enzimas aceleram a velocidade da reação reduzindo a energia do estado de transição.

As enzimas não somente aceleram as reações, mas também acoplam reações de maneira produtiva: Considere a energia livre (DG°’) necessária para transformar glicose em glicose-6-fosfato:

Glicose ® Glicose-6-Pi DG°’ = 4,0 kcal/mol

e a energia de hidrólise do ATP:

ATP   ®  ADP  +  Pi             DG°’ = -7,3 kcal/mol

A enzima hexocinase catalisa o acoplamento destas duas reações, gerando glicose-6-fosfato, com DG°’ de hidrólise -3,3 kcal/mol:

  Glicose + ATP  ®  Glicose-6-Pi   +  ADP  +  Pi

A transformação do substrato (reagente) em produto implica na interação Enzima-Substrato, conhecido como o modelo do encaixe induzido. Esse modelo propõe que a interação inicial entre a enzima e o substrato é relativamente fraca, mas é capaz de induzir modificações na estrutura da enzima, que atrai o substrato para o sítio catalítico. Ligada à enzima, a molécula do substrato sofre rearranjos que vão favorecer a transformação do complexo enzima-substrato de transição em produto.

Compare o comportamento de uma reação catalisada por enzima e uma reação não catalisada utilizando o simulador 1.

Observou que em altas concentrações do substrato (reagente) a velocidade da reação enzimática é quase independente da concentração do substrato?

Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten propuseram um modelo simples para explicar essas características cinéticas. Elas propuseram que uma enzima, E, combina-se com o substrato, S, formando um complexo ES, com uma constante de velocidade k1. O complexo ES pode dissociar-se para E e S, com uma constante de velocidade k2, ou pode prosseguir formando o produto P, com uma constante de velocidade k3. Na etapa inicial da reação, antes que a concentração de produto seja apreciável, quase nada do produto é revertido para o substrato inicial.

E + S <____> ES ___>E + P

A velocidade de catálise, ou velocidade inicial (v) é igual ao produto da concentração de ES por k3:

  v = k3[ES]                        (1)

A velocidade de formação de ES corresponde a k1[E][S]

A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3)[ES]

No estado estacionário ou no equilíbrio estacionário, a concentração de ES será constante, ou seja:

A velocidade de formação de ES será igual à velocidade de quebra:

k1[E][S] = (k2 + k3)[ES]        (2)

  Esta equação pode ser escrita de outra forma:

[ES] = [E][S] / (k2 + k3)/ k1       (3)

       A constante de Michaelis é definida como:

      KM = (k2 + k3)/ k1                 (4)

      e a equação (2) pode, então ser reescrita:

     [ES] = [E][S] / KM          (5)

Considerando que a concentração de enzima livre [E] corresponde à concentração de enzima total [ET], menos a concentração da enzima ligada [ES], a equação (4) pode ser apresentada assim:

    [ES] = ([ET] - [ES]) [S] / KM       (6)

ou:

    [ES] = [ET]( [S] / KM  /(1+[S] / KM))       (7)

ou ainda:

    [ES] = [ET]( [S] /([S] + KM))       (8)

Substituindo [ES] na equação (1) temos:

     v = k3[ET]( [S] /([S] + KM))       (9)

Quando os centros catalíticos estão saturados com substrato, a velocidade da reação é máxima (Vmáx). Nestas circunstâncias, [S] é muito maior do que KM e [S] /([S] + KM) se aproxima de 1. Dessa forma

Vmáx = k3[ET]

E a velocidade inicial, na equação (9), corresponde a:

      v = Vmáx[S] /([S] + KM))              (10)

Essa equação (10) explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas:

1) Quando [S] é muito maior do que KM, v = Vmáx; ou seja, a velocidade da reação é máxima e independe da concentração do substrato e a velocidade máxima de catálise (kcat) é igual a k3.

2) Quando [S] é muito menor do que KM, v = [S]Vmáx/ KM; ou seja, a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração de substrato. Esta situação é observada em condições fisiológicas, onde a relação [S] / KM encontra-se em torno de 0,01 a 1,0. Neste caso, a velocidade enzimática é muito menor do que k3 porque a maior parte dos centros ativos está desocupada e depende da velocidade de formação do complexo ES.

3) Quando [S] é igual a KM, v = Vmáx/2. Portanto, KM corresponde à concentração de substrato em que a velocidade da reação é a metade da velocidade máxima.

A maioria das reações catalisadas por enzimas pode ser analisada quantitativamente pela teoria proposta por Michaelis e Menten, que apresenta como elemento chave o KM. Em condições definidas de pH e temperatura, o KM para um dado substrato é característico. Essa constante pode ser calculada a partir do valor de Vmáx.

A determinação do valor de Vmáx com o auxílio da equação de Michaelis e Menten é difícil, uma vez que a curva hiperbólica gerada, apenas se aproxima do real valor de Vmáx. Esta equação pode ser transformada algebricamente em outras formas que se aplicam melhor no tratamento gráfico dos dados experimentais.

Uma transformação muito usada é aquela proposta por Lineweaver e Burk. Estes pesquisadores inverteram ambos os membros da equação proposta por Michelis e Menten e obtiveram:

1/v = ([S] + KM) / Vmáx[S]

ou:

1/v =  KM/ Vmáx[S] + [S] / Vmáx[S]

ou, ainda:

1/v =  (KM/ Vmáx)(1/[S]) + 1/ Vmáx

No gráfico gerado por esta equação, KM/ Vmáx corresponde à inclinação da reta, 1/ Vmáx, ao intercepto no eixo 1/v e –1/ KM, ao intercepto no eixo 1/[S]. Esse gráfico é conhecido como gráfico duplo-recíproco ou de Lineweaver-Burk e tem a grande vantagem de garantir uma determinação precisa do valor de Vmáx.

Utilizando os valores obtidos com o simulador 1, tente determinar a concentração de substrato ([S]) que gera a velocidade máxima (Vmáx) de uma reação catalisada por enzima.

Observe que, mesmo usando concentrações muito elevadas do substrato, o valor de Vmáx ainda será crescente. Utilizando a ferramenta Excel calcule os inversos de [S] e v construa o gráfico e calcule, com precisão, os valores de KM e de Vmáx.

O gráfico duplo-recíproco obtido a partir dos resultados de uma reação catalisada por enzima é muito útil na análise de reações enzimáticas em presença de inibidores.

Cada enzima apresenta um valor característico de KM e de Vmáx. Para a maioria das enzimas, o valor de KM está entre 10-1 e 10-7 M. Esse valor depende do substrato em particular e também das condições no sistema de reação, tais como pH, temperatura e força iônica.

KM corresponde à concentração de substrato em que metade dos centros ativa da enzima está preenchidos. Com isso, podemos avaliar a fração de centros ativos preenchidos (fES), com qualquer concentração de substrato, desde que KM seja conhecido:

fES = v/Vmáx = [S]/([S]+ KM)

Na equação (4) vimos que KM = (k2 + k3)/ k1       . Imaginando um caso limitante, em que k2 seja muito maior do que k3; isto significa que a dissociação do complexo ES em E mais S é mais rápida do que a formação de E mais produto. Portanto quando k3 é muito menor do que k2, KM é igual à constante de dissociação de ES. Em outras palavras:

KM alto     à       baixa afinidade entre enzima e substrato

KM baixo à       alta afinidade entre enzima e substrato

Utilizando, agora, o simulador 2 mantenha fixa [S] (cerca de 10 vezes maior do que o KM) e adicione valores crescentes de [E]. Em seguida construa um gráfico da velocidade inicial (v) em função de [E]. A porção linear da curva obtida pode ser usada para determinar a concentração da enzima presente em uma amostra desconhecida (soro sangüíneo, por exemplo), a partir da velocidade inicial.

Agora, utilize o simulador 3 e descubra:

1) Qual o substrato comum às duas enzimas.

2) Qual das duas enzimas é especifica para esse substrato.

3) Qual das duas enzimas tem maior afinidade por esse substrato.

Especificidade e afinidade da enzima pelo substrato são a mesma coisa?

A maioria das enzimas pode ser inibida por certos reagentes químicos. Essa inibição por pequenas moléculas e íons específicos é importante nos mecanismos de controle em sistemas biológicos. O estudo de inibidores de enzimas, também se constitui em uma fonte valiosa de informações sobre os mecanismos da ação enzimática.

Os inibidores podem ser agrupados em:

Inibidores irreversíveis – aqueles que se ligam ou destroem um grupo funcional, imprescindível para a atividade enzimática. A ligação pode ser covalente ou não e sua dissociação é muito lenta. O composto diisopropilfluorofosfato (DIFP), por exemplo, reage com uma serina, no sítio catalítico da acetilcolinesterase. A inibição da enzima compromete a transmissão dos impulsos nervosos.

Inibidores reversíveis – caracterizados por uma rápida dissociação do complexo enzima-inibidor. Podem ser de dois tipos:

Competitivos – em que a enzima pode ligar-se ao substrato ou ao inibidor, mas não aos dois simultaneamente. Uma vez ligado, o inibidor competitivo não sofre transformação. Esse tipo de inibição é revertido pelo simples aumento da concentração do substrato.

Não competitivos – nesse caso o inibidor liga-se à enzima em um local diferente do sítio ativo, alterando a sua conformação. Nesse caso a enzima pode ligar-se simultaneamente ao inibidor e ao substrato. O aumento na concentração de substrato, no entanto, não atenua a inibição.

As inibições competitiva e não competitiva apresentam características próprias. Utilizando o simulador 4 é possível observar que a Vmáx de uma reação catalisada por enzima, não sofre alteração na presença do inibidor, enquanto KM aumenta. Por outro lado, na inibição não competitiva, a Vmáx sofre redução (a concentração efetiva da enzima diminuiu), enquanto KM permanece o mesmo, quando em presença do inibidor.

Muitas enzimas apresentam propriedades cinéticas que não podem ser explicadas com o modelo proposto por Michaelis e Menten. Um grupo que apresenta estas características são as enzimas alostéricas, que freqüentemente apresentam gráficos de v em função de [S] em forma de S (sigmóides). A atividade destas enzimas pode ser alterada por moléculas que se ligam a locais diferentes do sítio catalítico e garantem sua regulação. Uma via metabólica envolvendo várias enzimas, normalmente tem uma etapa que limita a velocidade da reação. Essa etapa é catalisada por uma enzima alostérica.

Em outra classe de enzimas, envolvidas com a regulação do metabolismo, a atividade é modulada por modificação covalente de algum grupo funcional específico.

Existem algumas enzimas que apresentam múltiplas formas moleculares, mas que catalisam uma mesma reação geral e são chamadas de isoenzimas.

Mutações genéticas hereditárias podem gerar doenças que se caracterizam pelo funcionamento defeituoso de uma ou mais enzimas.

 

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