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Interferência de RNA   Apontamentos e texto/figuras da aula

(10-09-2009)

 

 

Alguns apontamentos preliminares:

 

Como em outras áreas da Genética Molecular,  a interferência de RNA deu aos seus descobridores o Nobel.

 

Um artigo em português sobre iRNA

Ricerte Filho, JCM & Kimura, ET (2006) -  MicroRNAs: Nova Classe de Reguladores Gênicos Envolvidos na Função Endócrina e Câncer. Arq Bras Endocrinol Metab vol 50 nº 6: 1102-1107

http://www.scielo.br/pdf/abem/v50n6/a18v50n6.pdf

 

Outro artigo em português sobre o assunto

Barbosa, AS & Lin, CJ (2004) - Silenciamento de Genes Com RNA Interferência: Um Novo Instrumento Para Investigação da Fisiologia e Fisiopatologia do Córtex Adrenal. Arq Bras Endocrinol Metab vol 48 nº 5: 612-619

http://www.scielo.br/pdf/abem/v48n5/a05v48n5.pdf

 

link para um paper on-line relativamente didático (em inglês)

 http://www.biolsci.org/v05p0097.htm

 

Link para fazer o download do vídeo de animação da revista Nature sobre iRNA

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

 

link para uma lista grande de tópicos sobre o assunto:

http://www.dmoz.org/Science/Biology/Biochemistry_and_Molecular_Biology/Gene_Expression/RNA_Interference/

 

 

Informações sobre iRNA na Wikipedia (muito bom, cheio de referências)

http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_interference

 

Link para NOVA ScienceNOW sobre aplicações médicas antevistas para iRNA

http://www.pbs.org/wgbh/nova/sciencenow/3210/02-cure.html

 

Imagens das apresentações de aula, com comentários

 

O processo de interferência de RNA, que leva à clivagem de um mRNA específico ou ao bloqueio da síntese de proteínas a partir deste mRNA, pode começar

a) pela injeção de um RNA fita dupla (dsRNA, do inglês double strand RNA)

b)pela síntese de um RNA que forme um longo grampo (a partir da transcrição de um trecho de DNA genômico ou de um transgene, engenheirado para isso e inserido no genoma do organismo), ou

c) pela síntese de um RNA de interferência, que será clivado pela enzima Drosha no núcleo, gerando um grampo que será, no citoplasma, clivado de nvo pela enzima Dicer.

Na figura ao lado está mostrado como o transcrito primário de um gene para miRNA (microRNA) presente no núcleo de uma célula é clivado pela enzima Drosha e o grampo gerado (que tem duas bases sobrando na extremidade 3´, formando o chamado 3´-overhang) é exportado do núcleo para o citoplasma.

 

É interessante notar que o gene para o miRNA (que não está mostrado, mas evidentemente faz parte do genoma) não leva à produção de nenhuma proteína. Por isso, ele não tem a configuração típica de um gene, com um quadro aberto de leitura (se não tiver introns) ou com exons e introns. Ele também pode ser bem pequeno. Por isso, muitos destes genes passaram despercebidos por todas as buscas de genes feitas na maioria dos genomas. Eles só começaram a ser descobertos depois da demonstração, por Fire e Mello, do princípio da interferência de RNA e, sobretudo, depois que se mostrou que este era um sistema de controle de expressão gênica encontrado em muitos organismos.

 

Com isso, o número de novos genes nos genomas  já sequenciados tem crescido. E o conceito de gene como um segmento de genoma que codifica uma proteína tem que ser definitivamente revisto e ampliado para conter estes genes, que codificam apenas pequenos RNAs que modularão a expressão gênica, através da clivagem do mRNA contra o qual são dirigidos.

 

Quando se gera um RNA fita dupla no citoplasma (por qualquer um dos 3 caminhos citados acima), as enzimas Dicer (picotador, em inglês) vão cortá-lo em pelo menos um fragmento de 21 pb, de novo com um overhang 3´de 2 bases em cada fita (a figura sugere isso), Diferentes grupos de seres vivos têm diferentes Dicer. Os mamíferos parecem só ter uma enzima Dicer, a drosófila tem duas (veja mais embaixo a terceira figura). Os pequenos fragmentos de dsRNA são então carregados num complexo enzimático formado pela enzima Argonauta e algumas outras enzimas, como uma helicase e uma enzima com domínio ligador de dsRNA, chamada R2D2. Um das subunidades leva embora uma das fitas de RNA e a outra (em geral a complementar ao mRNA alvo da futura clivagem) fica. Há um mecanismo de instabilidade da região 5´ do dsRNA que favorece a permanência da fita complementar no complexo, isto ainda está sendo mais investigado. Na figura ao ldo, a fita complementar está representada em vermelho, ligada à proteína Argonauta. Esta ligação é muito forte.

 

O passo seguinte do caminho para a interferência é o pareamento entre o RNA fita simples contido no Argonauta e o mRNA alvo, A probabilidade de um pareamento errôneo é muito remota, já que é preciso que haja o pareamento exato de pelo menos 19 das bases.  Assim que o pareamento for feito, duas coisas podem ocorrer:

a) se o mRNA não estiver sendo traduzido, ele será clivado (lado esquerdo da parte de baixo da figura ao lado).

b) se o mRNA estiver sendo traduzido, o Argonauta se liga a ele e leva a um bloqueio da tradução.

Em ambos os casos não vai haver mais a síntese de proteínas a partir do mRNA. Este é exatamente o objetivo da interferência de RNA.

 

Há alguns outros passos que não estão mostrados na figura ao lado, mas aparecem na animação da Nature. Um dos mais importantes é o destino dos dois fragmentos de RNA gerados pela clivagem. O fragmento terminal (3´) será imediatamente degradado pelas RNAses 5´-3´ da célula. O fragmento da direita (5´) também pode ser degradado pelas RNAses, mas por aquelas que agem no sentido 3´-5´. O outro destino é mais curioso: ele pode ser transformado em fita dupla pela RNApolimerase RNA dependente! Agora, um longo dsRNA vai estar disponível outra vez para a enzima Dicer. Cada novo pedaço gerado pode servir para carregar outro Argonauta ou ainda, quando espontaneamente se separam as duas fitas, a complementar ao mRNA pode parear com ele e servir de "primer" para a mesma RNApolimerase, embora ela não precise sempre de primer. Estes eventos estão mostrados na animação. Fica óbvio, pelas descrições acima, que o processo de interferência de acentua à medida que vai acontecendo, porque novos fragmentos ativadores da interferência vão sendo gerados, como numa reação em cadeia, até que o último mRNA seja degradado. Em muitos organismos, a interferência se espalha de uma célula para a outra, tomando o organismo todo, rovavelmente pela passagem de pequenos dsRNA pelas membranas. Os dsRNA são muito mais resistentes às RNAses em geral do que os RNAs fita simples e por isso têm mais chance de transitar entre células sem serem degradados.

 

Terceira figura (à esquerda): diferentes vias e diferentes Dicer em drosófila, verme (C. elegans) e mamíferos.

 

Na sala de aula no dia 9 de setembro de 2009 comentamos que, nos mamíferos, não havia evidência de existência de uma RNA polimerase RNA dependente e que, portanto, a via de degradação do fragmento de mRNA do lado esquerdo da clivagem (o fragmento 5´) era a mais provável neste grupo de organismos. Pois na última edição da Nature (NATURE| Vol 461| 10 September 2009), disponível um dia depois da aula, Maida e cols. mostram que a sub-unidade catalítica da telomerase, denominada TERT, e que era conhecida por sintetizar DNA a partir do RNA molde da telomerase, pode, quando associada a outra proteína (RMRP), ter uma clara ação de RNApolimerase RNA dirigida (RdRP), agindo na geração de dsRNA e ativando  sistema de interferência de RNA!!!! O paper pode ser acessado em:

http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7261/pdf/nature08283.pdf

 

Há um grande número de aplicações potenciais do mecanismo de iRNA, tanto para pesquisa como em produtos e serviços. Um dos mais interessantes é a geração de plantas transgênicas resistentes a vírus, porque se pode restrinir a replicação viral nestas plantas sem produzir uma única proteína nova, apenas um dsRNA dirigido contra um mRNA importante do vírus.  Outras aplicações podem ser encontradas nos papers e links fornecidos no início desta página

 

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