Aulas-sinopse

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Lista de temas: Índice dinâmico com hyperlinks para as várias aulas ou temas sequenciais de genética/ biologia molecular. Exceto para a primeira aula (uma sinopse intitulada Introdução), uma nova janela será aberta para cada aula selecionada.

(na prática nem toda aula listada aqui terá a duração de 3 horas, e algumas vezes parte de uma aula pode ser ministrada com parte de outra)

A Genética Molecular é uma área muito ampla da Genética, com forte interface com a Bioquímica, a Biologia Molecular, a Bionformática, a Física e a Fisiologia. Nos últimos anos, devido ao aumento extraordinário da informação genética produzido pelos programas de genômica estrutural e funcional, de microarrays e de proteômica (que agora se expande para o estudo de outros "omas", como o moleculoma e o metaboloma), a Informática passou a ser uma importante área de interface, criando a nova ciência que é hoje denominada Bioinformática. Todos estes campos do conhecimento são extremamente dinâmicos, o que implica dizer que os livros-texto em geral estão mais defasados dos temas atuais nestas áreas do que em outras, mais sedimentadas. Ainda assim, há um bom número de textos didáticos que devem ser consultados pelos interessados no assunto e podem ser vistos clicando aqui.

Nesta linha temática procuraremos inicialmente rever todas as etapas referentes ao fluxo da informação gênica, como mostrado na figura 1, numa abordagem genética, sem excessiva ênfase na bioquímica dos processos envolvidos. Assim, vamos discutir a síntese abiótica da vida, os primeiros sistemas de estocagem de informação genética e a hipótese do progenoto, antes de iniciar a discussão da replicação e transcrição do DNA. Em seguida, vamos discutir a transcrição do RNA e os vários tipos desta molécula, para finalmente chegar ao controle da expressão gênica no nível da transcrição e à síntese protéica.

Tomaremos como modelo básico a Escherichia coli, alertando em alguns pontos sobre as diferenças marcantes entre os mecanismos discutidos nesta espécie e nos eucariotos.

A segunda parte da disciplina será centrada na tecnologia do DNA recombinante. Iremos rever os sistemas de extração de DNA, análise eletroforética, sequenciamento, amplificação (PCR) e clonagem em vários vetores para usos diversos. Também trataremos de forma breve de outras técnicas de análise genética molecular, como o RAPD e o RFLP e suas aplicações (melhoramento, paternidade e pedigree, etc.).

Na terceira e última parte da disciplina veremos de forma breve como encontrar genes e regiões de interesse em bancos de dados, empregando ferramentas on line e off line. Será uma visão preliminar do que está sendo chamado hoje de data-mining, uma expressão emprestada pelos informatas de um processo semelhante desenvolvido para bancos de dados não biológicos. Este tema é uma pequena parte apenas da bioinformática, que não será tratada em profundidade nesta página.

O DNA é a molécula informacional por excelência. Os genomas de boa parte dos seres vivos (da totalidade, se não considerarmos os vírus entre os seres vivos) são formados por duas fitas complementares, numa estrutura circular ou distribuído em várias estruturas lineares. A esta estrutura dá-se o nome de cromossomo. No processo de replicação a informação genética contida nas fitas é copiada em duas novas fitas, que saem pareadas, cada uma, com as fitas antigas, num processo designado como replicação semi-conservativa. O DNA é uma molécula extraordinariamente estável e de composição química muito simples: a estrutura principal da fita é formada por um açúcar (a desoxirribose) ligada ao seguinte por uma ponte fosfodiester. As bases, que se ligam aos açúcares e estão voltadas para dentro da fita dupla, são de apenas 4 tipos: Adenina, Timina, Guanina e Citosina. As duas fitas se unem por pontes de hidrogênio entre as bases de fitas diferentes, numa regra fixa, conhecida como regra de Chargaff: A pareia com T através de duas pontes de hidrogênio, e G pareia com C através de três. Uma vez pareadas as fitas assumem a conformação de uma dupla hélice, com duas fendas helicoidais. A replicação da informação genética tem que ser um processo muito acurado, embora não desprovido de erro, pois, se por um lado o um excesso de erros levaria à morte da célula filha por mutações deletérias, por outro lado uma ausência total de erros em muitas gerações implicaria uma evolução lenta ou nula (erros no DNA podem ser introduzidos por outros mecanismos, além da replicação).

O RNA é o intermediário da informação genética nos organismos em que a informação genética primária está armazenada na forma de DNA. Os livros-texto em geral dividem os RNAs em três classes: RNAs mensageiros (mRNA), RNAs transportadores (tRNA) e RNAs ribossomais (rRNA). A existência do tRNA foi primeiramente proposta por Crick ainda na década de 50, muito antes de sua descoberta, a partir de considerações teóricas. Os rRNA, constituintes dos ribossomas (lembre-se que a sub-unidade leve tem um RNA e a sub-unidade pesada, dois), já eram conhecidos e os tRNA foram logo descobertos. Os mRNA de bactérias têm uma vida média muito curta, cerca de 60 segundos, o que faz com que seu isolamento e caracterização seja muito difícil. Os dois outros são muito mais estáveis. Os mRNA eucariotos, contudo, são bastante mais estáveis. Ainda assim é preciso extremo cuidado na purificação para que as RNases presentes nas soluções biológicas não degradem o mRNA celular que queremos purificar.

A síntese de RNA a partir do DNA é feita pela RNA polimerase e se chama transcrição. Cada base de DNA pode parear corretamente apenas com uma base no RNA, numa regra semelhante àquela proposta por Chargaff: A pareia com U, T com A, C com G e G com C.

Ainda na década de 50 Watson e Crick propuseram que a replicação da informação gênica fosse realizada apenas no nível do DNA e que necessariamente seria transcrita em RNA para finalmente ser traduzida em proteína (exceto nos casos de rRNA e tRNA). Entretanto, de forma independente, Howard Temin e David Baltimore, no início dos anos 70, propuseram que certos vírus teriam o genoma na forma de RNA, e empregariam o DNA como um intermediário replicativo. Para a síntese deste DNA estes vírus teriam a informação genética para a síntese de uma DNA polimerase RNA dirigida, chamada de forma mais simples transcriptase reversa. Apesar de veementes protestos do próprio Watson, a proposta mostrou-se verdadeira e os dois cientistas receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina anos depois (1975), juntamente com Renato Dulbecco. No processo de transcrição reversa o pareamento de RNA e DNA segue a regra descrita para a transcrição normal. As palestras de Baltimore, Temin e Dulbecco na entrega do Nobel podem ser encontradas na página de downloads, e são relatos eloquentes de seus trabalhos.

Alguns RNAs patogênicos, tais como viróides, e RNAs satélites, são RNAs circulares. Eles replicam pelo mecanismo de círculo rolante, produzindo uma longa fita de RNA. A clivagem desta fita nos vírus individuais é feita in vitro sem adição de qualquer enzima. Uma estrutura secundária do RNA denominada "cabeça de martelo" é a responsável pela auto-clivagem do RNA. Outras informações podem ser obtidas em

Na atual epidemia de dengue é importante lembrar que o vírus da dengue é um vírus a RNA que não emprega um intermediário de DNA para replicar, não sendo, portanto, um retrovírus, como o HIV.

O processo de produzir uma seqüência de aminoácidos a partir do RNA é chamado tradução e é o mais complexo dos processos no fluxo da informação genética. Um conjunto vasto de proteínas, co-fatores e o ribossomo, além do tRNA e do mRNA, são necessários para a síntese protéica. Diferentemente do que ocorre com os dois outros passos do fluxo da informação gênica, na tradução 3 bases de RNA formam um códon, que é interpretado pelo sistema de produção de proteínas como um aminoácido. Como há 4 bases, pode-se produzir 64 códons distintos, mas só há 20 aminoácidos usualmente empregados na síntese protéica. Logo, vários códons codificam o mesmo aminoácido. Isto faz com que, do ponto de vista matemático, a tradução seja uma função que não admite a sua função inversa. A incerteza no processo de produzir RNA a partir de proteína é o que provavelmente impediu o desenvolvimento de tal mecanismo pela Natureza.

Na verdade não há, na natureza, uma replicação de proteínas a partir de aminoácidos, analogamente ao processo de síntese ou replicação dos ácidos nucléicos. Entretanto, a produção de uma nova proteína a partir de uma proteína semelhante na maior parte dos aminoácidos é um processo recentemente proposto e que pode explicar a etiologia e epidemiologia de doenças como a encefalite espongiforme bovina (BSE ou doença da vaca louca) ou a doença de Creutzfeldt-Yakob (kuru ou a forma humana da BSE). O mecanismo empregaria a atividade exclusiva da proteína infectante que, uma vez encontrando uma proteína semelhante a ela, porém normal (em geral uma proteína da membrana do neurônio), a modifica de forma a transformá-la em uma proteína infectante igual a si mesma. O processo continua, cada vez que uma proteína infectante encontra outra normal, num processo que aumenta exponencialmente.

Durante muito tempo o kuru e outras doenças semelhantes foram atribuídas a lentivírus (dos quais o HIV é um exemplo), mas o vírus jamais foi isolado. Na década de 80 a teoria da proteína infectante, ou prion (fala-se príon), ganhou força e em 1997 seu proponente, Stanley Prusiner, recebeu o prêmio Nobel de Medicina. Em 1976 D.C. Gajdusek e B.S. Blumberg haviam recebido o Nobel pelos estudos sobre o kuru. Entretanto, a indicação de Prusiner causou enorme polêmica, pois muitos cientistas ainda discordam da hipótese do prion e acreditam que um vírus pode ser a causa destas doenças. As Palestras Nobel de Gajdusek e Blumberg podem ser obtidas do site de download. Uma apresentação on-line do conceito de prion pelo próprio Prusiner é uma outra sugestão de leitura.

A doença da vaca louca ganhou bastante popularidade nos últimos 10 anos, depois de sucessivas epidemias na Europa, e particularmente na Inglaterra. A transmissão se dá exclusivamente pela ingestão de produtos obtidos da carcaça de vacas doentes, o que implica que as vacas infectadas comeram carne ou outros produtos de vacas doentes. Mas não implica que as vacas sejam canibais, pois a pecuária moderna fornece a herbívoros ração produzida à base de carcaças de animais da mesma espécie ou de outras. Vacas ingerem assim carne de vaca, carneiro ou peixe, e ovelhas alimentam-se da mesma forma, através da ração. A proibição do uso de produtos bovinos na ração de bovinos chegou, entretanto, tarde demais para evitar o enorme prejuízo e a mortandade aplicada ao rebanho bovino na Europa no fim da década de 90.

A transmissão entre seres humanos era devida ao antropofagismo, nas tribos indígenas da Papua, mas atualmente ocorre pelo uso de hormônio de crescimento humano ou por transplante de órgãos de doadores infectados, mas assintomáticos.

A doença aparece esporadicamente como mutação do gene que codifica para a proteína do neurônio, numa taxa muito baixa (< 1:1.000.000). Ainda não está claro se o prion da vaca ou da ovelha pode infectar o homem: parece haver uma forte barreira entre espécies para este tipo de agente infeccioso. Para maiores informações consulte a principal home-page sobre o assunto: http://www.mad-cow.org/

Recentemente, um artigo publicado no PNAS mostrou que prions de camundongo podem ser encontrados nos músculos do animal. A publicação provocou uma certa inquietação na mídia, e um artigo do New York Times comentou as consequências se o mesmo for verdadeiro para outras "carnes". Veja o link.

Julga-se que a superfície da terra esfriou suficientemente para ser compatível com a vida há cerca de 4,5 milhões de anos atrás. Apesar da atmosfera muito diferente da de hoje (o oxigênio não existia, por exemplo), a vida foi criada rapidamente, provavelmente a partir de processos abióticos. O registro fóssil, embora fragmentário por natureza, aponta para a existência de seres semelhantes a bactérias em extratos rochosos de 3,5 milhões de anos atrás.

Assim, a vida foi criada muito precocemente, essencialmente quase imediatamente após o necessário resfriamento (Stephen J. Gould, The Evolution of Life on Earth). Entretanto, nada diferente destas "protobactérias" pareceu existir por longo tempo, até que cerca de 1 bilhão de anos atrás começou a surgir alguma diversidade biológica, culminando com a chamada explosão cambriana, há 600 milhões de anos atrás. Por que foi tão rápido gerar a vida a partir da "sopa" primordial, através de processos abióticos, e tanto tempo foi preciso para diversificá-la significativamente? Há muitas explicações possíveis, mas aparentemente a mais simples é que o clima não permitia a criação de organismos mais complexos. Pode ser que o acaso não os tenha favorecido, porque a evolução não caminha na direção de maior complexidade. Ver para isto a elegante argumentação no artigo do Gould citado aqui. Além do mais, temos que ter em mente que evolução não significa necessariamente complexidade: é evidente que houve evolução das formas simples de vida, entre seu surgimento, há 3,9 milhões de anos, e o período imediatamente anterior à explosão cambriana. Esta evolução não pode ser atestada, infelizmente, pelo registro fóssil, porque todas as formas de vida eram muito simples e o critério de diferenciação morfológica teria aqui pouca utilidade.

Ainda na temática de evolução, deve-se considerar também que, antes da criação da vida, houve uma contínua evolução dos sistemas bioquímicos formados abioticamente. Podemos agora supor que vários sistemas bioquímicos autosustentáveis em algum grau surgiram e evoluíram nos primeiros 600 a 800 milhões de anos (ver para tal a revisão de Brian Davis, Molecular evolution before the origin of species, formato pdf, 1,2 Mb), e foi a associação destes vários sistemas num espaço fechado por uma bicamada lipídica que criou a possibilidade primeira de um organismo vivo. É muito provável que, antes da criação deste organismo, o RNA fosse a molécula informacional mais usada, pois é relativamente fácil de ser obtido abioticamente. É quase certo também que, naquele tempo, o RNA era muito mais estável pois empregava bases alternativas às atuais, que eram mais resistentes ao meio ambiente. É provável também que as RNAses não fossem tão eficientes e ubíquas como são hoje. O DNA, por outro lado, não pode ser obtido desta forma, e deve ter sido criado pela primeira vez a través de uma transcriptase reversa primitiva. Se os primeiros organismos tinham DNA fita simples ou dupla como informação genética básica não se sabe.

A partir do momento em que foram criadas as condições para o aumento da complexidade da vida na Terra, formas progressivamente mais complexas foram surgindo por evolução. Temos sempre a idéia de que isto ocorreu no cambriano, constituindo a famosa Explosão Cambriana, mas houve um período imediatamente anterior a este em que a complexidade da vida já havia iniciado. É o período que vai do Vendiano ao Ediacarano, este último ocorrido cerca de 20 milhões de anos antes do início do Cambriano. Até há pouco tempo acreditava-se que esta biota havia desaparecido devido a uma extinção em massa na fronteira entre o Ediacarano e o Cambriano, mas evidências recentes mostram que isto pode não ser verdade: vários organismos inicialmente classificados como do cambriano poderiam ter sido originados no Vendiano/ Ediacarano. Para uma revisão sobre o assunto veja o ótimo site Peripatus e para uma lista dos mais antigos taxa, vá direto à sub-página relativa ao assunto do site Peripatus.

Não podemos saber quantas vezes a Natureza "descobriu" o DNA, mas os organismos que existem na atualidade parecem todos terem uma origem única. Assim o progenoto teria dado origem aos 3 grandes grupos de seres vivos que povoam a Terra: arqueobactérias, eubactérias e eucariotos.

Figura 1: Duas representações da origem da vida, que aparecem em várias fontes consultadas. Na primeira (A) os três grandes grupos de seres vivos estão em três troncos independentes. Na segunda visão (B) eucariotos e bactérias "primitivas" estão num mesmo tronco.

Mesmo esta divisão arqueobactérias, eubactérias e eucariotos, parece fadada a ser substituída por uma mais complexa. Para tal vamos nos apoiar na leitura de um paper recente de Hedges e cols. (2001), que pode ser acessado gratuitamente no endereço http://www.biomedcentral.com/1471-2148/1/4

Para mais discussão sobre este assunto, o leitor deve visitar, neste website, a página da Pós-Graduação, e estudar os artigos disponibilizados no link Mestrado sobre a origem da vida e o período pré-biótico.