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7 PCR - Uma técnica de mil e uma utilidades

Esta aula é bastante longa. Por isso optamos por construir internamente links para seus diversos temas, tabelados abaixo. Basta clicar sobre o tema de interesse.

Sinopse da aula

Primeiros passos - Introdução ao PCR
RAPD - uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer DNA!
PCR na investigação de Paternidade
PCR na investigação de crimes
PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas
PCR em tempo real - o sistema Taqman
Um pouco de história
Artigos importantes sobre PCR
Link para a aula de PCR da disciplina Técnicas Moleculares na Biologia

 

7.1 Primeiros passos

Ainda na década de 60 muitos pesquisadores procuraram obter a síntese de DNA in vitro. É evidente que obter DNA em tubo de ensaio é o primeiro passo para um universo de experimentos em genética molecular. O primeiro a conseguir caminhar neste sentido foi Arthur Kornberg, de quem já falamos na aula sobre replicação do DNA. Era natural, já que Kornberg era um profundo conhecedor das DNA polimerases. A síntese de um DNA viral in vitro foi recebida com entusiasmo por todos, inclusive a imprensa leiga, que qualificou o feito como a criação da vida em laboratório. Esta metáfora tem sido usada pela imprensa com insistência em várias ocasiões, sempre que se trata de manipular o DNA de um ser vivo, e em geral provoca mal estar entre os pesquisadores, o que foi o caso de Arthur Kornberg.

Em 1983, Kary Mullis, então pesquisador empregado na Cetus Corporation, EUA, imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase iniciasse e terminasse seu trabalho em trechos pré-determinados do DNA. Com o sistema seria possível amplificar milhões de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de DNA. A idéia foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985, numa conferência. Depois disso a técnica, conhecida como PCR, ganhou quase instantaneamente uma aceitação mundial e em menos de uma década tornou-se o procedimento básico de todo laboratório de genética molecular no mundo.

Mas, afinal, o que é a PCR?

A sigla significa "polymerase chain reaction", que em português seria reação em cadeia da polimerase. Então, a base da técnica é a ação in vitro da DNA ´polimerase. Para compreendermos como funciona a técnica, que é na verdade bem simples, precisamos recordar que, para iniciar a síntese de uma fita nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e de precursores de síntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP).

A idéia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de DNA feitos em laboratório, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro, que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distância entre os sítios de pareamento dos dois primers não podia ser muito grande, e foram escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reação era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais, até 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequência alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e outro na cópia recém sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4 cópias do alvo. É claro que a repetição do processo geraria um número de cópias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2.

Na verdade, a coisa não foi tão fácil assim: a DNA pol era termoinstável (como a maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94 oC. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão. Além disso, a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de pareamentos espúrios (sem sentido, errôneos) no sistema, gerando ao final produtos de PCR inesperados.

A solução foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituída por uma DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta extraordinariamente útil na genética molecular. Que propriedades têm a Taq polimerase que a fazem tão útil? Ela é termoestável e sua temperatura ótima de funcionamento é 72 oC. Com isto três problemas ficaram automaticamente resolvidos:

a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.

b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridização, que podia ser mantida acima de 50 oC, evitando hibridizações espúrias.

c) o DNA molde não se renaturava por completo, permitindo uma rápida desnaturação ao se iniciar um novo ciclo.

Adicionalmente, a manutenção do tubo fechado evitava contaminação do material do laboratório e dos estoques de reagentes com os amplicons, nome genérico dado aos produtos de amplificação da PCR. É claro que um amplicon gerado com um par de primers qualquer serve perfeitamente de molde para uma nova reação de PCR com os mesmos primers. A contaminação de reagentes e pipetas com amplicons continua sendo um problema para todos que trabalham com PCR. 

Os eventos ligados às três temperaturas que mencionamos, 94 oC, 50 oC e 72 oC, estão esquematizados na figura abaixo. Observe que, a 94 oC, os primers e as fitas simples de DNA alvo estão misturados, mas não podem parear. Quando a temperatura é reduzida os primers rapidamente alcançam seus sítios de complementariedade, pois são moléculas pequenas e, portanto, muito móveis, e porque estão em concentração muito mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde tende a renaturar, mas logo a temperatura é novamente elevada para 72 oC, que permite a extensão das novas fitas a partir dos primers, sem desparear os primers outra vez. Por fim, a temperatura volta a 94 oC, que desnatura todas as fitas, inclusive as recém sintetizadas, recomeçando o processo.

Figura 7.1 Eventos relacionados às três temperaturas básicas da PCR: Desnaturação a 94 oC, pareamento dos primers a 50 oC e extensão de novas fitas a 72 oC, supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estável.

 

O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento variável, obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um vírus ou plasmídeo), e outra, de comprimento determinado, que é obtida sempre que um DNA previamente copiado é empregado como molde em sua síntese.

Esta situação está claramente representada na figura abaixo, que mostra os três primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a fita estendida a partir de um primer hibridizado com o DNA molde original não tem comprimento fixo, porque o molde é muito longo. Seu comprimento final vai ser determinado  pelo instante em que o primer hibridizar com o sítio de complementariedade e pela tempo de extensão total, à temperatura de 72 oC. As duas primeiras fitas estendidas estão indicadas com a letra e à sua direita. Já as fitas que são produzidas a partir de primers que hibridizaram em fitas previamente copiadas têm fatalmente ser comprimento definido, já que inicia, no primer e terminam ao fim do DNA molde, que é exatamente a e extremidade 5´do primer já incorporado na fita molde. As fitas de comprimento definido aumentam de número exponencialmente, formando aos poucos um imenso número d fita duplas de comprimento definido, enquanto as fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo, por alvo). Uma inspeção da figura a seguir esclarecerá o leitor sobre esta questão.

Figura 7.2  Produção de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Após hibridização dos primers a 56 oC, as fitas novas são sintetizadas a 72 oC, dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo). Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação.

A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de poliacrilamida, que corre verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação UV, "corando" previamente o DNA com brometo de etídio (esta substância se intercala entre as fitas de DNA e nestas condições absorve o UV e fluoresce com cor alaranjada).  O produto de PCR será sempre um DNA fita dupla e o que distingue um do outro, no gel, será apenas o comprimento relativo. Esta situação está representada no esquema da figura seguinte.

Figura 7.3  Visualização de três reações de PCR. Em a e b dois produtos são gerados, a partir de dois pares de primers diferentes. Os dois produtos têm comprimentos de 400 e 360 pb. A migração das bandas na eletroforese é de cima para baixo. O fragmento menor migra mais rápido e produz a banda em vermelho. O maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. A coluna c é um controle negativo, essencial em qualquer reação de PCR. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA - DNA ladder - de 100 pb). Na transiluminação ou na coloração por prata, evidentemente, todas as bandas têm a mesma cor.

Quando fazemos um PCR, a prática aconselha a deixar o tubo com os reagentes por 5 a 10 minutos a 94 oC antes de iniciar o ciclo. Em geral 1 minuto a cda temperatura é suficiente para as etapas do ciclo, que é repetido de 35 a 40 vezes. Por fim, ao terminar a última extensão muitas vezes os protocolos experimentais sugerem a manutenção da temperatura de 72 oC por mais 5 a 10 minutos. A opção de esperar 10 minutos antes de começar o ciclo, mantendo o tubo aquecido, garante que todo o DNA alvo esteja desnaturado antes de se iniciar o ciclo. Por outro lado, o período final a 72 oC garante que todas as fitas terão o mesmo comprimento pois pode acontecer que, durante o ciclo, algumas fitas copiadas não tenham atingido o fim do molde. A figura a seguir sintetiza o ciclo da PCR.

Figura 7.4. Ciclo padrão de uma PCR. Antes de iniciar o ciclo o tubo com os reagentes é mantido a 94 oC para garantir a desnaturação inicial de todo DNA alvo. Da mesma forma, ao terminar o ciclo, a manutenção do tubo a 72 oC garante que todos as fitas tenham exatamente o mesmo número de bases.

 

Quando PCRs são realizadas, gerando produtos de diferentes comprimentos, e estes produtos são analisados por transiluminação UV em gel de agarose, o resultado que se obtém pode ser semelhante ao mostrado abaixo. O menor dos produtos migra mais rápido e gera a banda mais em baixo no gel. Em geral o gel de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode ser necessário usar um gel de poliacrilamida.

Figura 7.5  Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (número total de pares de bases) (colunas 2 a 5). Na coluna 1 estão os marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido, obtidos por digestão por enzima de restrição de um DNA conhecido ou sintetizados por máquinas. A coluna 6 é um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel é apenas a fronteira da eletroforese.

Nos dias de hoje uma PCR é feita numa máquina chamada termociclador. É simplesmente um bloco aquecido, controlado por um sistema digital, que eleva e abaixa a temperatura do material nele inserido (tubos de ensaio pequenos, micro-placas de 96 poços, etc), de acordo com a programação digitada pelo operador. Mais de duas décadas foram necessárias para que estas máquinas pudessem atingir um grau de precisão e confiabilidade aceitáveis, aliado a um preço razoável. Também os reagentes para PCR reduziram de preço consideravelmente na última década, tornando o método comercialmente atrativo. Uma reação de PCR pode, agora, ser feita por US$ 1,00.

Além do cuidado com a contaminação de amplicons, a PCR exige atenção em vários outros detalhes. Um deles diz respeito ao pareamento dos primers: a última base da extremidade 3´ do primer tem que estar corretamente pareada com o DNA alvo, sem o que não ocorrerá amplificação. No restante do primer a necessidade de um pareamento exato não existe e, na extremidade 5´podemos até mesmo adicionar um segmento fita simples que não vai parear com o DNA alvo. Este ressalto (overhang) não atrapalha em nada a reação e pode adicionar propriedades importantes ao nosso amplicon final. Vejam um exemplo disso na construção da biblioteca de cDNA na aula 6!

Outro ponto importante é a questão dos erros na sequência devido à tautomeria de bases. A Taq polimerase não faz revisão (proof reading) in vitro. Se, ao copiar pela primeira vez o DNA alvo, ela introduzir uma base errada numa das duas fitas, 25% do produto final estará com sua sequência diferente nesta base. As consequências deste erro podem ser trágicas se estamos procurando fazer um diagnóstico genético (veja item correspondente). Para evitar isto todos os testes são feitos em duplicata. A idéia é que a probabilidade da Taq polimerase "errar" nas duas reações sempre na primeira extensão é muito reduzida e se um resultado conflitante surgir, fica claro que num dos tubos a Taq "errou". Se o "erro"  for cometido depois do terceiro ciclo ele já se torna praticamente imperceptível, pois uma pequena porcentagem das fitas terá erro e não será possível detectá-lo facilmente.

Seria ideal que pudéssemos disponibilizar em Downloads um relato de Mullis sobre o PCR a partir da sua apresentação na Academia Nobel. Entretanto, não há na página da Academia Sueca que coordena o Nobel (http://www.nobel.se) as palestras de Kary Mullis e Michael Smith. Uma apresentação on-line dos trabalhos dos dois laureados Nobel em Química, do ano de 1993 está disponível: Michael Smith (pelo aperfeiçoamento da tecnologia da mutação sítio-dirigida) e  Kary B. Mullis (pela invenção da PCR).

 http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/illpres/index.html

 

7.2. RAPD - uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer DNA!

Uma limitação séria na PCR convencional é a necessidade de se conhecer previamente a sequência que se quer amplificar ou, pelo menos, suas extremidades, para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se, contudo, baixarmos a temperatura de hibridização (pareamento) para menos de 45 oC, poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos sítios do DNA. Em verdade, não precisamos sequer de dois primers, basta um.

Uma PCR feita com um só primer e empregando uma temperatura de hibridização (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera, muitas vezes, um número considerável de bandas em muitos diferentes DNAs, através do pareamento com baixa estringência do primer (em geral ele também, pequeno, com 10 a 15 bases, o que facilita os pareamentos). O curioso é que, se repetirmos o experimento nas mesmas condições experimentais, obteremos as mesmas bandas mais uma vez. As bandas, então, não são uma amplificação completamente aleatória de trechos de DNA, mas sim de trechos flanqueados por sequências que pareiam com o primer com baixa estringência, o que é muito diferente. Apesar disso, a técnica de PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato é rápida, mas o nome - randomly amplified polymorphic DNA - DNA polimórfico amplificado aleatoriamente - dá margem a certa confusão. Se, por um lado, o pareamento não é aleatório completamente, por outro a existência das sequências com homologia é de fato aleatória, pois não sabemos de antemão se um DNA terá regiões com complementariedade para o primer escolhido.

A figura abaixo mostra esquematicamente o resultado de um RAPD. Observe que as bandas coloridas podem ser amplificadas de cromossomas diferentes ou do mesmo cromossoma, mas os primers que as flanqueiam (e a todas as demais bandas) são sempre os mesmos.

Fig. 7.6a Representação esquemática do resultado de um RAPD empregando DNA extraído de indivíduos de três populações distintas de insetos (a,b,c), (d,e) e (f,g,h). Os indivíduos i e j não tinham origem determinada e poderiam pertencer a qualquer um dos três grupos. A semelhança do padrão de bandas com o primeiro grupo sugere a origem. Na parte de baixo da figura uma representação esquemática dos sítios de pareamento que geram as bandas representadas em vermelho, azul e amarelo.

 

Idealmente um RAPD deve gerar um número de bandas superior a 4, e estas bandas devem ser polimórficas (isto é, com diferentes migrações) para indivíduos diferentes, ao menos entr grupos distintos. Isto, contudo, nem sempre ocorre. Ainda assim, o RAPD é uma técnica extremamente poderosa porque os marcadores são bastante polimórficos e porque se pode testar um grande número de primers em cada situação. Além disso a técnica é rápida e de baixo custo. A figura a seguir mostra o resultado de um experimento real do Gentrop/ UFPE, no contexto do trabalho desenvolvido pelo nosso colega Valdir Balbino. DNA de diferentes exemplares de Lutzomyia longipalpis, o vetor da leishmaniose visceral nas Américas, foi empregado em reações de RAPD. Os exemplares provieram de uma mesma localidade. Pode-se observar o acentuado polimorfismo destes marcadores.

Fig7.6b  RAPD obtido de exemplares de Lutzomyia longipalpis, inseto vetor da leishmaniose visceral. Todos os exemplares foram capturados no município de Calumbi, PE, a a amplificação feita com o primer OPP-04 (cortesia Valdir de Queiroz Balbino). A primeira coluna à esquerda é a escada de DNA de 100 pb. A terceira banda mais forte, de cima para baixo, corresponde a 600 pb.

O RAPD permite não apenas discriminar entre populações diferentes de organismos, mas inferir sua correlação filogenética. A técnica tem, contudo, suas limitações, sendo a mais grave a dificuldade em reproduzir exatamente os mesmos resultados de um laboratório para outro.

 

7.3. PCR na investigação de Paternidade

Uma das aplicações mais conhecidas da PCR é a investigação de paternidade. Técnicas bioquímicas ou moleculares (voltadas ao DNA) já existiam muito antes da descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnósticos baseados em PCR que a investigação de paternidade alcançou o mercado com mais abrangência, pela redução dos custos do exame e democratização dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties).

Para se compreender como funciona a técnica precisamos recordar um pouco a organização do genoma humano ( e de muitos outros organismos complexos). Apenas 3% do nosso genoma é composto de genes. Há, ao contrário, uma enorme parte dele composta de repetições mais ou menos longas, conforme o caso. Não sabemos ainda porque isto ocorre, mas estas repetições podem ser usadas vantajosamente como marcadores moleculares em muitos casos. Como não são genes, não estão sob uma pressão seletiva tão grande e mostram muito mais variação do que as sequências de genes propriamente ditas.

Dentre as regiões repetidas a investigação de paternidade por PCR costuma empregar uma classe de repetições conhecidas como STR - small tandem repeats ou pequenas repetições em tandem. São pequenas regiões de DNA com um número variável de repetições de 3 ou 4 nucleotídeos cada, flanqueadas por regiões conservadas. Um esquema simplificado de um STR está mostrado na figura abaixo. Como os seres humanos e os demais mamíferos são diplóides, cada região de um cromossomo (exceto nos machos o par XY) está presente no outro. Elas não precisam, contudo, ser exatamente iguais. Na representação da figura abaixo chamamos alelos as duas rgiões homólogas nos dois cromossomos, por analogia ao que fazemos com genes, embora os STRs não sejam genes. Observe que as regiões repetidas estão flanqueadas por regiões conservadas que se estendem à esquerda (5´) e à direita (3´) das repetições. Para qualquer ser humano estas regiões conservadas são as mesmas, mas cada um de nós pode ter um número diferente de repetições em cada alelo. Quanto maior o conjunto de diferentes repetições maior será a informação colhida pela realização da análise da região.  Assim, se o número de repetições para o caso estudado (cada caso é chamado sistema e em geral empregam-se 8 a 16 sistemas, cada um lançando mão de um STR de um cromossoma diferente) varia, digamos, de 3 a 15, haveria 12 possibilidades em cada alelo. Apenas como exercício, se a probabilidade na natureza fosse a mesma para qualquer uma das repetições (i.e., a frequência alélica fosse a mesma), a probabilidade de um indivíduo qualquer ter o arranjo de 4 e 9 repetições mostrado abaixo seria 1/12 x 1/12 = 1/ 144.

Fig 7.7 Representação esquemática de um STR e sua amplificação por PCR, através de primers dirigidos às regiões flanqueadoras conservadas. Os dois produtos gerados tem comprimentos diferentes pois a parte interna da sequência difere de um alelo para o outro.

Quando o sistema acima é analisado em gel de agarose, duas bandas serão visíveis se o indivíduo for heterozigoto para aquele STR. No caso de investigação de paternidade, o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da mãe. Isto que dizer que, para um sistema qualquer, o filho terá um STR (e uma banda) materno e outro paterno. A figura abaixo retrata a situação onde um casal avalia a paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem claramente uma banda de origem materna e a segunda banda está na mesma altura da banda paterna. Portanto, o marido não pode ser excluído de ser o pai. No segundo caso, contudo, a criança tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda paterna. Esta situação exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. 2).

Fig. 7.8 Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação de paternidade. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o resultado da amplificação de um sistema para o suposto pai, a mãe e dois filhos. A banda materna de cada filho está indicada e a banda paterna de um deles está contornada com uma elipse. O teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo filho.

A inclusão obrigatória da mãe em testes de paternidade evita que uma eventual troca de recém-nascido na maternidade possa confundir os resultados. O mesmo processo descrito acima pode ser empregado em qualquer animal que tenha reprodução sexuada. É preciso apenas identificar os STRs candidatos e avaliar criteriosamente a distribuição dos alelos na população em estudo. Para os seres humanos os alelos estão distribuídos igualmente em todas as populações do globo, mas em  bovinos, por exemplo, devido ao cruzamento controlado pelo produtor, os STRs estão distribuídos de forma muito diferente de uma raça para outra. Ainda assim, a avaliação de pedigree em animais de raça é um campo crescente de aplicação desta tecnologia.

Apenas como lembrete: os STRs não são os únicos alvos possíveis para investigação de paternidade via DNA. Além disso, a investigação bioquímica e genética de paternidade já era um método bem estabelecido muito antes da invenção do PCR. Sugerimos que o leitor mais interessado procure informações na internet para complementar esta questão.

 

7.4. PCR na investigação de crimes

Outro campo fértil para o uso da PCR é a criminalística. A possibilidade de amplificar um pequeno trecho de DNA milhões de vezes permite, em muitos casos, amplificar de uma pequena amostra biológica (mancha de sangue, bulbo de cabelo, fragmentos de pele), mesmo em um estado de conservação, suficiente DNA para uma análise de STRs como a descrita acima. Um caso clássico é a investigação da procedência de uma mancha de sangue no casaco da vítima (ou resto de pele sob as unhas da vítima). Supondo, para fins deste exemplo, que o material não contivesse restos de células da própria vítima, o procedimento para análise do caso estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo.

Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com duas bandas (aparecerá apenas uma se o indivíduo for "homozigoto" para aquele STR). Na amostra as duas bandas do suspeito 2 estão claramente visíveis. O suspeito um tem apenas uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O teste exclui dois indivíduos, mas não prova, como na paternidade, que o outro é o "dono" da amostra. A inclusão do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de não exclusão (como no caso de paternidade) para 99,99999999%. Isto quer dizer que não podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de 99,99999999%.

 

Fig. 7.9 Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação criminal. Três suspeitos estão sendo investigados e uma amostra de sangue está disponível.  A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificação de um sistema para os possíveis criminosos. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra. O padrão de duas bandas é idêntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.

Os casos de estupro, em geral, trazem uma complicação adicional: o material colhido na vítima (por exemplo, esperma do criminoso) está misturado com o DNA da vítima (e com muito DNA contaminante não humano, da flora vaginal). Nestes casos o DNA dos suspeitos é sempre misturado com o DNA das vítimas antes da amplificação dos STRs. O resultado é feito por comparação do padrão de 4 bandas das misturas de DNA, uma a uma, de suspeito + vítima, com o padrão obtido da amostra colhida da vítima no corpo de delito. A figura abaixo ilustra este caso.

Fig. 7.10 Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação criminal. Três suspeitos estão sendo investigados num caso de estupor e uma amostra de sangue está disponível.  A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificação de um sistema para os possíveis criminosos, sempre em mistura com o DNA da vítima.. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra colhida no corpo de delito que, supostamente contendo DNA da vítima e do criminoso. A última coluna da direita é a amplificação apenas do DNA da vítima. O padrão de quatro bandas da amostra é idêntico ao do suspeito 3 e exclui os demais.

As aplicações forenses (na justiça) da PCR são ilimitadas, mas não há espaço aqui para maior detalhamento.

 

7.5. PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas e na identificação de portadores sãos de alelos mutantes.

Doenças genéticas podem, algumas vezes, ser difíceis de diagnosticar. Adicionalmente, no aconselhamento genético de casais é importante determinar inequivocamente se um indivíduo é portador de um alelo mutante (portador são). A identificação de mutações em genes pode ser feita também por PCR, em geral com a manipulação posterior do produto de amplificação. A seguir exemplificamos duas destas aplicações. Numa delas o nucleotídeo mutado faz parte de um sítio de restrição (se você lembrar que são mais de 600 as enzimas de restrição, cada uma com seu próprio sítio, não será muito difícil encontrar uma que corte um sítio incluindo o nucleotídeo em estudo). Na outra um artifício permite detectar qualquer nucleotídeo mutado, faça ele parte de um sítio de restrição ou não.

A figura abaixo ilustra o caso em que o sítio de restrição para EcoRI, GAATTC, inclui um nucleotídeo que está frequentemente mutado no caso da doença genética em estudo. No alelo normal o sítio de restrição está preservado e no alelo mutante ele foi perdido, pela troca de um par AT por um GC. Se o contrário tivesse acontecido, a técnica também poderia ser aplicada da mesma forma, apenas com a mudança equivalente na interpretação dos resultados. Quando o trecho de DNA em estudo é amplificado por dois primers anelando nas regiões acima e abaixo da mutação (em princípio todo o restante do gene é conservado), os produtos gênicos terão o mesmo tamanho, sejam provenientes do alelo normal (wt - wild type)ou do mutante. Então, será preciso uma  intervenção nos produtos para que uma distinção entre eles possa aparecer. Isto é feito pela ação da enzima de restrição escolhida (no caso, a EcoRI). O produto de PCR produzido a partir do alelo normal pode ser clivado pela enzima de restrição, dando origem a duas bandas. O produto originado da amplificação do alelo mutante não tem mais o sítio para EcoRI e não pode ser clivado, permanecendo do tamanho original. Assim, num indivíduo heterozigoto (portador são de uma mutação recessiva) o sistema produzirá três bandas: a maior, correspondente ao produto de PCR do alelo mutante, que não pôde ser clivado pela EcoRI, e duas menores, fruto da clivagem do produto de PCR do alelo normal.

Fig. 7.11  Princípio da identificação de mutações pontuais através da eliminação/criação de sítios de restrição e geração de fragmentos de digestão com polimorfismo de comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para a marca estudada. A mutação elimina um sítio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplificação dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digestão destes fragmentos com a enzima EcoRI gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo não cortado, enquanto o alelo selvagem é clivado em dois pedaços de tamanho distinto.

Na avaliação do resultado da PCR/RFLP discutida acima, o gel deve mostrar uma banda única apenas para o indivíduo afetado (homozigoto mutante, com clínica da doença), já que os produtos de PCR dos dois alelos não podem ser clivados pois perderam o sítio de restrição para EcoRI. Já o homozigoto normal terá seus os produtos de PCR de dois alelos clivados e no gel apenas duas bandas estarão visíveis. Apenas no caso já discutido (portador são, heterozigoto wt/m) serão visíveis três bandas. A figura abaixo representa de forma esquemática o resultado de uma análise PCR/RFLP.

Fig. 7.12  Resultado da investigação da presença de mutação no sítio EcoRI por PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para a marca estudada (coluna b), um indivíduo afetado e um normal homozigoto. A mutação elimina um sítio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplificação dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digestão destes fragmentos com a enzima gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo não cortado, enquanto o alelo selvagem é clivado em dois pedaços de tamanho distinto.

 

Em muitos casos de mutações pontuais a técnica de PCR/RFLP não pode ser aplicada, seja porque não há sítio de restrição conhecido para o entorno da mutação, seja porque múltiplas mutações são possíveis no gene de interesse, tornando a abordagem acima impraticável. Uma alternativa é o mis-match PCR, ou PCR com pareamento errôneo. O princípio desta técnica, descrito pela primeira vez por Cotton et al., em 1988, e também conhecido com CMC - chemical mismatch cleavage - baseia-se na clivagem de DNA em locais com pareamento errôneo pela piperidina, e está representada na figura abaixo. Um indivíduo heterozigoto tem uma mutação pontual numa região qualquer do gene. Podemos amplificar esta região com primers dirigidos a suas extremidades, como fizemos na PCR/RFLP. Em seguida aquecemos o produto do PCR e deixamos esfriar rapidamente para induzir a formação de heteroduplexes (uma fita simples de um alelo e a complementar do outro) além dos homoduplexes (as dus fitas pareadas de volta, de um mesmo alelo). Nas região não pareadas ou com pareamento errôneo com bases C e T liga-se o produto hidroxilamina ou o tetróxido de ósmio, respectivamente. Uma vez ligados, estes produtos permitem a clivagem do DNA neste local pela piperidina. Assim, 50% dos produtos de PCR serão cortados por este sistema em todo lugar onde houver uma mutação. Em geral os fragmentos gerados pro este sistema são pequenos e devem ser visualizados em gel de poliacrilamida. A figura abaixo mostra como funciona este sistema.

Fig. 7.13  Resultado da investigação da presença de mutação em uma base desconhecida pela técnica de PCR-mismatch. A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para a marca estudada: o alelo selvagem tem o par TA e o mutante o par GC. A amplificação por PCR do trecho onde a mutação está usa primers que estão a alguma distância à direita e à esquerda da provável mutação. Quando o produto do PCR é aquecido os dois tipos de fita (TA e GC) se separam, dando origem a 4 fitas simples. Quando a mistura é rapidamente aquecida, as fitas simples se reassociam ao acaso de 4 formas distintas, pois a diferença de uma única base não impede o pareamento das fitas quase complementares. Após o uso de um sistema químico adequado, os pares de base errôneos são clivados e as fitas com mis-match geram dois fragmentos no gel, ao contrário das fitas com pareamento perfeito. O heretozigoto aparece, no gel, com três bandas (veja figura abaixo).

O resultado do experimento descrito acima está esquematicamente representado na figura seguinte. O portador são, heterozigoto, tem uma mutação na posição descrita na figura anterior. O primeiro afetado tem esta mutação nos dois alelos. Já o segundo afetado tem um alelo com a mutação da figura anterior e outro alelo com uma mutação mais a direita, como representado na barra vertical ao lado do gel.

Fig. 7.14  Resultado da investigação da presença de mutação pela técnica de mismatch PCR. A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para a marca estudada (coluna b), dois indivíduo afetados e um normal homozigoto. A amplificação dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a clivagem destes fragmentos pela piperidina gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo não cortado, enquanto o alelo selvagem é clivado em dois pedaços de tamanho distinto. No caso do primeiro afetado (homozigoto) não há mismatch interno porque os dois alelos são idênticos. Nocaso do afetado heterozigoto cada alelo é diferente do outro em dois pontos distintos, o que gera três fragmentos pela piperidina, mais o produto não clivado do homoduplex.

Não se deve esquecer, contudo, que a presença de um mismatch não significa diretamente uma mutação, pois há na natureza diferenças individuais entre qualquer ser vivo. Estad diferenças, que não significam doença mas diferenças simples entre indivíduos são chamadas  SNPs. O teste final para o reconhecimento de presença de uma mutação é, de fato, o sequenciamento direto do produto de PCR. Se houver diferença entre os alelos, no lugar correspondente eletroferograma haverá duas bases possíveis (p.ex. T ou A). (veja aula sobre sequenciamento, a seguir). A consulta num banco de dados público de SNPs será essencial, também (ver aula de Introdução à Bioinformática, mais adiante).

 

7.6. PCR em tempo real - o sistema Taqman

Recentemente foi desenvolvido um sistema pela empresa Applied Biosystems (fundida com a Celera na atual Applera), para detectar o produto do PCR à medida em que esta vai sendo sintetizado na reação. O engenhoso sistema é baseado no uso de uma sonda, dirigida contra uma região interna da sequência que se deseja amplificar, e que tem dois fluorocromos, um em cada extremidade da sonda (um DNA fita simples). Na extremidade 5´ há um fluorocromo que só fluoresce se estiver distante fisicamente do fluorocromo na posição 3´. Este segundo fluorocromo funciona como capturador de energia (quencher) e não deixa com que a energia luminosa usada para excitar a sonda chegue em quantidade suficiente para excitar o primeiro fluorocromo. Estes dois fluorocromos estão representados como R e Q (para quencher). Quando o primer hibridiza na região 5´, a sonda também o faz no meio da sequência. À medida em que a Taq polimerase avança sintetizando a  fita nova, ela vai degradando a sonda à sua frente, liberando o fluorocromo R da sonda e permitindo que absorva energia e emita luz. A energia para a excitação dos fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra e o equipamento que faz isto chama-se PCR em tempo real (real time PCR) ou Taqman. A figura abaixo esclarece este princípio.

Fig. 7.15  Princípio de funcionamento do Taqman, ou PCR em tempo real. Uma sonda fita simples com dois florocromos é adicionada à reação de PCR. O fluorocromo Q atua com atenuador da fluorescência de R, sendo protanto um quencher. Para isto é preciso que esteja próximo a R. A TAq polimerase separa os dois fluorcromos à medida em que degrada a sonda quando sintetiza a fita nova. O fluorocromo R recém liberado da sonda emite então  luz num comprimento de onda característico, diferente de Q. A excitação dos fluorocromos é feita com laser que atravesse o tubo de reação.

A medição da radiação é feita pelo aparelho, que taça um gráfico com a absorção obtida após cada ciclo de PCR. O ciclo em que o patamar (limite) de negatividade é ultrapassado está diretamente relacionado à quantidade de DNA molde na mistura. Com isto, a quantificação de DNA molde passou a ser não apenas possível, mais rápida. O sistema ainda é bastante dispendioso mas tenderá a se tornar mais barato à medida em que novos sistemas entrarem no mercado e um maior número de máquinas for disponível.

Fig. 7.16   Gráfico obtido com o Taqman. A seta indica o ciclo em que a reação ultrapassa o limite da reação negativa. Quanto menor a quantidade de DNA molde no tubo de reação maior o número de ciclos necessários para ultrapassar o limite da negatividade. A reação de PCR no Taqman emprega em geral apenas duas temperaturas (94 oC para desnaturação e 60 oC, para hibridização e extensão) e o resultado da PCR pode ser dado em menos de 30 minutos.

 

7. 7  Um pouco de história

em construção

A reação em cadeia da polimerase foi desenvolvida a partir de uma idéia de Kary B. Mullis.

K. Mullis nasceu em 1944 em Lenoir, Carolina do Norte, EUA. Obteve o grau de bacharel em química em 1966 no Instituto de Tecnologia da geórgia e o PhD em Bioquímica pela Universidade da Califórnia em Berkeley. Passou então 7 anos como pós-doutor em Cardiologia Pediatria e Química Farmacêutica na Escola de Medicina da Universidade de Kansas (EUA). Em seguida reebu um convite para trabalhar como técncio na Cetur Corporation, em Emeryville, em 1978. Foi lá que teve a idéia da PCR.

Segundo ele, foi dirigindo seu carro de San Francisco para sua casa em La Jolla, California, que ele começou a imaginar uma maneira simples de determinar uma sequência de nucleotídeos a partir de um trecho de DNA. Ele então, como querem para si outros cientistas, tece uma inspiração súbita: a solução não era apenas para seu problema original, mas tinha um alcance muito maior. Ele imaginou uma forma de fazer a DNA polimerase iniciar e terminar seu trabalho em pontos pré-determinados e, consequentemente, pelo uso desta proipriedade, descobriu uma maneira de amplificar exponencialmente uma sequencia de DNA num tubo de ensaio.

Mullis então levou a idéia para seus colegas da Cetus e juntos eles a colocaram para trabalhar de verdade. Ela foi apresentada pela primeira vez ao público numa conferência em 1985 e foi pronta e amplamente aceita pela comunidade científica. A popularidade da técnica, assim como seu conceito, ganhou crescente popularidade ao longo dos anos seguintes.

Em 1989 a revista Science escolheu a molécula usada na PCR, a Taq polimerase, como a primeira  "Molécula do Ano".

Em 1991 a PCR se tornou extremamente comum em laboratórios pelo mundo afora e referências ao uso da técnica já somavam milhares nas revistas científicas. Um ano depois a Cetus, depois de uma reorganização corporativa, vendeu a patente da PCR para a Hoffman - La Roche por US$ 300.000.000,00.

Devido ao alcance e popularidade da PCR Kary Mullis foi apontado e recebeu o prêmio Nobel de Química em 1995. Esta indicação foi duramente contestada por muitos que acreditavam que a PCR foi apenas um desenvolvimento de técnica e que sua concepção não era suficiente para dar a Mullis o status de nobelista. Mullis argumentou a seu favor que a união das técnicas pré-existentes no formato por ele criado fazia toda a diferença.

Para uma história um pouco mais detalhada sobre o desenvolvimento da PCR veja o site http://usitweb.shef.ac.uk/~mba97cmh/history/history.htm

 

7.8 Artigos importantes sobre PCR

Uma seleção dos mais importantes artigos sobre PCR, tanto durante o desenvolvimento da técnica quanto para diversas aplicações, pode ser encontrada na página específica da Universidade de Berkeley:

http://sunsite.berkeley.edu/pcr/foundationalPCR.html#anchor1239949

Vale a pena conferir!

 

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