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2. DNA: estrutura e replicação

2.a. A Natureza química do gene

Até cerca de 50 anos atrás a natureza química do gene era um mistério. Temos a tendência a imaginar que a descoberta do DNA como a molécula que armazena a informação genética na maior parte dos seres vivos foi feita por um único grupo de pesquisa, de uma só vez, e sem correlação óbvia com os trabalhos anteriores. Procuraremos mostrar que este não foi o caso, ao mesmo tempo que comentaremos os pontos mais importantes que pavimentaram a ciência moderna conhecida como Genética Molecular. Uma visita histórica dos vários experimentos que levaram à demonstração de que a matéria poderia armazenar informação (havia cientistas que afirmavam que a vida era "codificada" por uma essência imaterial, semelhante à alma, e que os genes eram feitos desta substância...) pode ser encontrada na excelente página do COG: Marcos da História da Genética.

As suspeitas recaíram sobre o DNA já nos tempos fundadores da Genética. De fato, em preparações coradas de células em divisão era possível visualizar cromossomos. Estes cromossomos repartiam-se precisamente entre as células filhas, o que fazia supor que eles teriam correlação com a informação genética. Ora, que os cromossomos tinham DNA em sua composição também já era sabido pois Johann Miescher em 1869 já havia definido a natureza química do ácido nucleico.  Já se sabia mesmo que o DNA era uma molécula muito grande. Porém, e isto não se encaixava muito com o gosto científico prevalecente no mundo ocidental de então, o DNA era uma molécula relativamente "monótona": era composta apenas de adenina, guanina, timina e citosina, fosfato e um açúcar, a desoxirribose. Estes elementos se repetiam de uma forma aparentemente aleatória e, ao final, todos os DNAs estudados tinham a mesma porcentagem de adenina e timina, assim como a mesma porcentagem de citosina e guanina. Além disso, muitos DNAs isolados de mamíferos, anfíbios, peixes, aves e moluscos tinham uma porcentagem quase igual das quatro bases. Como uma molécula tão pouco "criativa" poderia ser o depósito de toda a informação genética capaz de produzir um novo indivíduo?

Novas observações, contudo, viriam reforçar a tese do DNA como material genético. As experiências de Griffith (1928) com Diplococcus pneumoniae foram muito importantes por terem fornecido a base experimental para o estudo aprofundado da participação das diversas macromoléculas na transmissão da informação gênica. O D. pneumoniae é letal para camundongos e cresce em meio de cultura sólido formando colônias de aspecto liso. Um mutante desta bactéria forma colônias rugosas e não é letal para o camundongo. O autor observou que a linhagem selvagem (virulenta), uma vez aquecida por certo tempo, morria, e a inoculação deste material no camundongo não produzia qualquer sinal de infecção. Se, entretanto, as bactérias mortas pelo calor eram inoculadas no camundongo junto com bactérias mutantes vivas, muitos dos animais inoculados morriam. As bactérias isoladas das carcaças dos camundongos formavam agora colônias lisas! Como explicar tal fenômeno? Batizado com o nome de transformação, o fenômeno podia ser facilmente explicado admitindo que um "princípio transformante" liberado pelas bactérias mortas levava a marca de virulência para as bactérias não patogênicas vivas, transformando-as. Da mesma forma, extratos obtidos das bactérias recém transformadas eram capazes de transformar outra vez mutantes não patogênicos. A figura abaixo resume as experiências fundamentais de Griffith (Griffith, F., The significance of pneumococcal types. J. Hyg. (1928) vol: 27, pgs. 113-159).

Figura 1: Griffith evidenciou que o princípio transformante (que fazia com que uma bactéria não virulenta assumisse uma forma letal para o rato) era termoestável e possivelmente formado por ácido nucleico (com maior probabilidade de ser o DNA). Na figura a data está errada: o artigo foi publicado em 1928.

Na década seguinte muitos diferentes laboratórios mostraram que extratos obtidos de bactérias diversas poderiam transformar mutantes para marcas como virulência ou resistência a metais pesados. Qual a natureza química deste material transformador? Deveria ser, necessariamente, uma molécula termoestável. O DNA é termoestável, mas muitas proteínas também são. Nesta época a maior parte dos pesquisadores acreditava que genes eram compostos de proteínas. Logo, a proteína deveria ser a macromolécula com capacidade transformante. Assim, foi com grande surpresa (e desconfiança) que o mundo científico recebeu, 15 anos depois do trabalho de Griffith, os resultados de Avery, MacLeod e McCarty, em 1944 (Avery, 0. T., MacLeod, C. M., and McCarty, M., Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcel types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus Type III. J. Exp. Med.  (1944), vol 79, pgs. 137-158). Os autores concluíram ser o DNA o princípio genético ativo através de experimentos semelhantes ao de Griffith, mas empregando placas de Petri para avaliar a transformação (pelo formato das colônias) e purificando previamente o "princípio transformante", por um procedimento que resultava numa preparação muito pura de DNA.

O princípio transformante podia ser purificado de bactérias mortas pelo calor ou por bactérias lisadas (nesta última forma, o rendimento era superior). Por vários critérios bioquímicos e físico-químicos distintos este material era DNA. Havia, na preparação, uma pequena porcentagem (menos de 0,2%) de aminoácidos, o que serviu para alimentar um grupo de críticos ao experimento, que argumentavam ser a pequena fração residual de proteína a responsável pela transformação e o verdadeiro mensageiro genética, e não o DNA. Poucos anos depois do experimento ser publicado ficou demonstrado que a pequena fração de aminoácido presente era resultante da degradação parcial da adenina, que resulta em glicina. As bactérias avirulentas podiam ser transformadas (isto é, podiam produzir colônias com o formato característico das formas virulentas) a partir de uma quantidade muito pequena de DNA (cerca de 1 ng/ml). Se o princípio transformante fosse tratado com RNAse ou proteases (tripsina ou quimiotripsina), ele continuava ativo, mas era totalmente inativado com diminutas concentrações de DNAse.

Para verificar a transformação das bactérias avirulentas em virulentas pelo DNA os autores lançaram mão da propriedade que têm estas bactérias (Diplococcus pneumoniae) de formar colônias com aspecto liso, se foram virulentas, ou rugoso (se forem avirulentas). A diferença de aspecto é devida ao fato de que as bactérias virulentas têm uma cápsula, que as avirulentas não possuem. Quando bactérias avirulentas eram apresentadas, num tubo de ensaio, ao extrato das bactérias virulentas por algum tempo, algumas delas se transformavam. Assim, em meio a muitas colônias rugosas, formadas pelo plaqueamento de uma pequena gota deste tubo numa placa de Petri com meio de cultura adeuado, via-se algumas colônias lisas, produzidas pela transformação.

Os experimentos eram de fato absolutamente claros. A comunidade científica, contudo, recebeu-os com extremo ceticismo ou simplesmente preferiu não conhecê-los. Muitos acreditavam que as conclusões só seriam aplicáveis aos pneumococos. Avery e seus colegas publicaram seus resultados numa importante revista científica (The Journal of Experimental Medicine), porém pouco lida pelos biólogos moleculares, principais interessados no esclarecimento do papel e da estrutura do DNA. Só 10 anos depois é que o real valor destes resultados foi apreciado pela comunidade científica. Por quê? Tendemos a ver o cientista como analista absolutamente frio dos fatos, chegando a conclusões que muitas vezes contrariam claramente a teoria vigente. Mas isto jamais ocorre. Desde a escolha de um tema para a pesquisa, passando pelo planejamento dos experimentos, até a interpretação dos resultados, há sempre uma influência decisiva da mentalidade científica prevalente, dos preconceitos e conceitos estabelecidos pela sociedade na qual se vive. Ao meio do nosso século ainda vivíamos deslumbrados pela tecnologia advinda da virada do século e aperfeiçoada nas quatro décadas seguintes. Ninguém poderia achar que algo aparentemente simples pudesse desempenhar um papel incrivelmente complexo. O DNA era "simples demais" para servir a papel tão nobre quanto o de levar a informação genética para fazer um homem...De fato, até ao próprio Avery sua descoberta lhe pareceu uma surpresa, e em carta a seu irmão, ele comenta: "quem diria!"

Muitos outros experimentos vieram se somar aos de Avery e seus colegas (cujo conteúdo está resumido no texto (formato pdf) de Horsfall et al., 1952, em downloads). Entre os resultados mais importantes estão a determinação da quantidade exata de DNA numa célula e sua duplicação e conservação ao longo do ciclo de vida celular. Novas técnicas localizaram DNA sempre onde havia cromossomos e nunca onde eles não estavam presentes. Além disso, foi demonstrado que o DNA era metabolicamente estável: tinha uma longa vida média, quando comparada à das proteínas, o que lhe dava vantagens como repositório da informação genética. Entre os experimentos que mais impressionaram os cientistas estava o de Hershey e Chase; estes autores mostraram que a marcação radiativa do DNA de um bacteriófago acompanhava a "mensagem genética", entrando no citoplasma da bactéria infectada, enquanto que a marcação radioativa específica para proteínas permanecia no exterior ou aderida à face externa da membrana bacteriana. A figura a seguir resume este experimento.

Figura 2: Experimento de Hershey e Chase

Apesar de ter sido recebido com bastante entusiasmo, e de ser citado em todos os livros-texto de genética, este experimento está bastante distante de ser tão conclusivo como os de Avery e cols., pois houve uma porcentagem significativa de marcação de proteína no citosol bacteriano e, da mesma forma, um pouco de DNA no exterior das bactérias. A aclamação destes resultados foi grande porque, publicados em 1952, já encontraram madura a comunidade científica para a aceitação do DNA como veículo da informação gênica. De fato, os experimentos de Hershey e Chase não demonstram coisa alguma, apenas sugerem o que estava claro nos experimentos de Avery et al. (1944).

Um importante avanço na compreensão do papel do DNA como mensageiro da informação genética foi a retomada dos métodos antigos de purificação de DNA, que haviam sido substituídos, a partir da década de 30, por métodos mais rápidos mas mais agressivos. Estes métodos novos estavam reduzindo o DNA a pequenos fragmentos de 4 nucleotídeos, e a idéia de que o DNA natural era um longo polímero havia sido quase esquecida. Os métodos antigos eram mais gentis com a molécula, resultando em fragmentos muito maiores de DNA.

Outro ponto que vinha causando dificuldade na aceitação do DNA como mensageiro genética era a idéia, extremamente difundida, de que o RNA era a molécula informacional em plantas. Isto era bastante aceito pela comunidade, essencialmente por erros na metodologia da extração de ácidos nucléicos em vegetais. Hoje sabemos que todos os reinos têm o DNA como molécula informacional.

Uma revisão da história da descoberta do DNA, de Griffith a Hershey e Chase, bastante crítica quanto ao fundamento filosófico e às personalidades de cada pesquisador, pode ser encontrada na página de downloads, escrita por Pollock na década de 60.

A aceitação das hipóteses mais inovadoras em ciência geralmente é bastante lenta. E mesmo se há um certo entusiasmo de uma parte da comunidade científica, há relutância da maioria. A seguir transcrevemos um pequeno trecho da entrevista que Kornberg, descobridor da DNA polimerase  e de várias outras enzimas importantes na replicação e transcrição de DNA, deu a um jornalista na década de 70, sobre vários assuntos. Aqui pinçamos a questão do trabalho de Avery e cols., que ilustra o impacto relativo da descoberta no seu tempo. A reportagem na íntegra pode ser lida em

http://sunsite.berkeley.edu:2020/dynaweb/teiproj/oh/science/kornberg/@Generic__BookTextView/2651;pt=2685;lang=rs

Pergunta: A importância do experimento de Avery foi aceito de uma forma geral antes de se tornar claro que o DNA era a molécula informacional? (queremos aqui alertar ao leitor: na própria pergunta está embutida a idéia de que só com a descoberta de Watson e Crick - a estrutura do DNA -ficou claro que esta era a substância genética, como foi a palavra usada na pergunta, traduzida aqui de forma mais moderna para molécula informacional).

Kornberg: Avery, e Macleod e McCarty, que eram seus pesquisadores associados mais jovens, claramente perceberam isto e, na sua maneira muito modesta de se expressar, Avery compreendeu suas implicações. Como eu disse, um elemento chave na demonstração dada no seu trabalho foi o fato de que uma enzima foi purificada, e que ela era específica para degradar DNA. Uma protease não fazia o mesmo efeito, isto é, só a DNAse destruía o princípio transformante, como eles chamavam a substância genética naquele tempo.

Poderíamos argumentar que o DNA poderia agir como um arcabouço ou uma engenhoca protetora que mantivesse o verdadeiro material genético, a proteína, num estado ativo. Algumas pessoas realmente usaram este argumento, eles de fato desafiaram a afirmação de que o DNA era o material genético, inclusive Alfred Mirsky, que era um biólgo muito importante na mesma instituição de Avery (O Instituto Rockefeller para Pesquisa Médica). Assim a afirmação era controversa ao seu tempo.

O DNA também não era o centro das atenções da bioquímica ou da biologia, como se tornou depois. Eu já disse várias vezes que os geneticistas do Caltech, que eram o grupo mais importante em 1952, davam pouca atenção ao DNA antes do experimento de Hershey e Chase. Seria preciso fazer uma pesquisa profunda para saber quão difundida foi a aceitação ou rejeição da hipótese do DNA como mensageiro da informação genética, mas eu certamente afirmaria que ele não era o centro da atenção, nem que a hipótese foi amplamente aceita.

Acho que o ponto fundamental aqui é mostrar que todos puxam a brasa para sua sardinha. O importante não foi tanto a DNAse ser purificada, mas sim ser livre de atividades RNásica e proteásica. Por outro lado, muito mais importante foi o uso de um princípio transformante altamente purificado, que era simplesmente DNA, por vários critérios bioquímicos testados. O experimento é, portanto, diferente do que está descrito na maior parte dos sites e livros, inclusive aqui, na sua versão até dez/2002 !!!!!! Por isso também (isto é, porque o princípio transformante era DNA purificado), a argumentação de Minsky e outros era insustentável e fruto apenas da tradição de ser dar à proteína todo o papel importante no metabolismo celular.

No início da década de 50, diversos grupos se dedicavam ao estudo da estrutura do DNA, tentando criar um modelo que explicasse sua função e a forma com que era replicado (duplicado) durante a divisão celular. A competição feroz (e nem sempre leal) entre estes grupos é um assunto fascinante e está relatada por James Watson em um livro sobre a descoberta da estrutura do DNA. Não há dúvida que esta descoberta revolucionou a genética e alicerçou todo o desenvolvimento posterior da genética molecular e da tecnologia do DNA recombinante (engenharia genética).

 

2.b. A estrutura do DNA

A estrutura do DNA é hoje em dia conhecida por qualquer colegial bem informado, assim como a Teoria da Relatividade. Porém, como a Relatividade, sua compreensão é parcial e, para fins de pesquisa, realmente insuficiente. Também para aqueles que desejam estudar as novas técnicas em genética molecular, é fundamental um conhecimento mais aprofundado da estrutura do DNA, de sua replicação e dos mecanismos de transcrição da informação gênica. Mais uma vez lembramos que não pretendemos dar todo este conhecimento através deste texto, mas apenas servir de guia para o estudo do assunto.

A estrutura em hélice dupla para o DNA foi proposta por Watson e Crick, que se basearam em parte nos resultados da difração de raios X , obtidas por Rosalind Franklin. O modelo proposto em 1953 é o que chamamos hoje em dia de DNA B. Nesta hélice as duas cadeias de DNA estão ligadas entre si por pontes de hidrogênio, que são ligações fracas não covalentes, formadas entre bases opostas nas duas cadeias (ou fitas). O pareamento é muito específico: a base purínica Adenina pareia somente com a base pirimidínica Timina, enquanto que a outra base purínica, Guanina, pareia com a base pirimidínica Citosina. Por isso, o número de bases A tem que ser igual ao de T, enquanto o número de bases C será sempre igual ao de G. O pareamento AT e GC (regra de Chargaff) se faz por duas e três pontes de hidrogênio, respectivamente. Assim, a sequência de bases de uma fita não é igual à da outra, porém complementar: dada a sequência numa fita, a sequência de bases da outra estará prontamente determinada.

Estas características do modelo de Watson e Crick são bem conhecidas. Há outras, menos conhecidas porém não menos importantes. As duas fitas são antiparalelas. O que significa isto? Para compreender esta característica é preciso antes discutir-se um pouco a forma com que uma nova molécula de DNA é feita. Arthur Kornberg isolou no fim dos anos 50 uma enzima capaz de duplicar o DNA em tubo de ensaio. Esta enzima, chamada DNA polimerase, adiciona as bases nitrogenadas de uma fita (usando os precursores desoxi-adenosinatrifosfato, ou dATP, e as três outras, dTTP, dCTP e dGTP) a partir da informação contida na outra. A enzima "lê" a fita molde e faz a fita complementar. Mas ela só realiza este trabalho num sentido quimicamente determinado: como ela faz ligações fosfodiester 3’-5’, cria uma nova fita que se estende da extremidade 5’-fosfato para a extremidade 3’-OH. Uma análise da representação plana da dupla fita de DNA, mostrada na figura a seguir, esclarece esta direcionalidade da síntese de DNA. Como foi dito acima, as fitas de DNA são antiparalelas: significa dizer que elas "correm" em direções opostas e são replicadas também em direções opostas.

Figura 3: Modelo plano de uma molécula de DNA, mostrando as fitas duplas antiparalelas. As extremidades 3’, embora representadas aqui com uma hidroxila ligada a elas, estão na prática ligadas aos fosfatos do nucleotídeo seguinte, nas cadeias pré-formadas. Apenas na cadeia nascente há uma hidroxila livre.

Pelos seus trabalhos fundamentais ao esclarecimento da replicação do DNA Severo Ochoa e Arthur Kornberg foram agraciados com o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1959. Suas palestras Nobel podem ser encontradas em nosso site de downloads.

Ao se entrelaçarem, as duas fitas formam duas fendas, mais ou menos como um parafuso que tivesse dois fios ao invés de um. É através destas fendas que a maior parte das proteínas que interagem com o DNA "lêem" as sequências de bases que estão voltadas "para dentro". Mais adiante veremos como é vital para todo o controle e fluxo da informação genética a interação precisa entre proteínas diversas e sequências determinadas do DNA. Os modelos da fita dupla, mostrados a seguir, esclarecem este ponto.

 

Figura4: Modelo da fita dupla de DNA, de acordo com Watson e Crick, visto de perfil. NH = azul, O = vermelho, P = amarelo

Pela descoberta da estrutura do DNA James Watson, Francis Crick e também Maurice Wilkins (no laboratório do qual trabalhou Rosalind Franklin, com as análises cristalográficas de raios X), receberam o Prêmio Nobel em 1962. As Palestras Nobel dos três podem ser encontradas no site de downloads. Ao tempo da premiação, a Dra. Rosalind Franklin já havia falecido (O Nobel não é concedido senão a cientistas vivos). O papel de Rosalind Franklin nesta grande descoberta foi sempre minimizado pela misogenia da sociedade científica da época (e, em menor grau, a de hoje também), mas está sendo resgatado em importantes artigos. Para tal, e para outras importantes informações, consulte a detalhada revisão da história do DNA, vital para qualquer um interessado em biologia e medicina, recentemente colocada na Web pela revista Nature, e que será atualizada periodicamente e está disponível de graça em http://www.nature.com/nature/DNA50/.

Há pelo menos três modelos de DNA que são frequentemente citados nos livros-texto: os modelos A, B e Z. O DNA B é de longe o mais frequente, mas o DNA Z também é encontrado na célula. Admite-se que o DNA Z é "silencioso", isto é, não pode ser transcrito. A transição B-Z seria, assim, um recurso para silenciar grandes blocos de genes. A forma Z é também a única que é imunogênica, isto é, quando um paciente tem anticorpos contra DNA, é contra esta forma que eles são produzidos.

Figura 5: Os três modelos mais citados de DNA: A, B e Z. Nesta figura está bem visível a fenda maior entre a volta verde de cima e a vermelha de baixo e a menor, entre a vermelha de baixo e a verde da base, no modelo B. Também fica claro que os dois modelos A e B são hélices dextrógiras, enquanto o Z é levógiro. Também dá para perceber que o DNA Z não tem duas fendas nítidas, mas uma escancarada e outra muito discreta.

Por fim, devemos nos lembrar que o DNA pode assumir a forma circular ou se organizar em cromossomos lineares. A Natureza aparentemente começou a "experimentar" com genomas circulares de DNA fita dupla. Só mais tarde, quando a informação genética necessária para perpetuar a espécie começou a se tornar demasiado grande, é que a solução de múltiplos cromossomos lineares teve que ser adotada.

 

2.c. A replicação do DNA

Todos aprendemos na escola (e algumas vezes também na Universidade) que a replicação do DNA começa de uma das extremidade. A forquilha de replicação vai se abrindo à medida em que, na frente, as duas fitas antigas se desenovelam, enquanto que, mais embaixo, duas novas fitas vão sendo sintetizadas e, por sua vez, se enovelam nas fitas antigas; formam-se com isto duas novas cadeias duplas de DNA, cada uma contendo uma fita nova e uma fita velha. A replicação é dita, por isso, semi-conservativa. Sem negar o valor didático desta representação é preciso que se tenha claro em mente que isto não ocorre jamais. A replicação, mesmo de um genoma linear curto como o de um vírus, costuma se iniciar de um ponto interno no genoma. O DNA circular das bactérias também se replica a partir de um único ponto (e, necessariamente, interno). Genomas maiores têm múltiplas origens de replicação. Para cada lado da origem de replicação a replicação avança, de tal forma que duas "forquilhas" acabam se encontrando.

Há diversas outras imprecisões a cerca da replicação do DNA, que têm consequências graves na compreensão de muitas das técnicas em genética molecular. Procuraremos a seguir sanar algumas delas, antes de passar à transcrição, isto é, à síntese de RNA a partir de DNA.

Como foi dito acima, a DNA polimerase só sintetiza uma nova fita de DNA no sentido 5’-3’. A consequência é que, mais uma vez, a imagem da forquilha de replicação comentada no início do texto está errada. Se, de um lado, a fita nova pode ser feita de forma contínua, de fora para dentro (da extremidade aberta para o fundo da forquilha), do outro lado a síntese tem que ser feita de dentro para fora! Por isso a fita feita desta forma é chamada fita descontínua. Ela é formada inicialmente por fragmentos de DNA, conhecidos como fragmentos de Okazaki. Cada vez que um trecho suficientemente longo de DNA fita simples está disponível, inicia-se a síntese de um novo fragmento de Okazaki, de dentro para fora da forquilha. Após sua síntese uma enzima liga o fragmento recém sintetizado ao fragmento sintetizado anteriormente. Desta forma engenhosa a síntese das novas fitas de DNA é sempre feita no sentido 5’-3’.

Mas ainda esta imagem é imprecisa: falta um aspecto fundamental da replicação do DNA, que é consequência outra vez da forma com que a DNA polimerase atua. A DNA pol não consegue estender uma nova fita de DNA se não houver um pequeno trecho de DNA ou RNA pareado na fita molde acima (ou 5’) do segmento que será sintetizado. A figura abaixo representa a síntese de um trecho de uma nova fita pela DNA pol a partir de um "primer" (pronuncia-se "práimer") ou iniciador.

Figura 6: Representação esquemática do início da síntese de uma fita nova de DNA. A DNA polimerase apoia-se no segmento de DNA pareado à fita molde e, adicionando nucleotídeos na direção 5’-3’, estende a nova fita.

Como ocorre na natureza, durante a replicação do DNA? Quem é o primer? Para orientar nossa discussão, imaginemos que a replicação comece realmente da extremidade da fita dupla, como nas figuras usuais que aprendemos na graduação. Para que a síntese das fitas novas progrida é necessária a adição de dois primers: um na extremidade da fita molde que servirá para dirigir a síntese da fita contínua, e outro mais para o interior da forquilha de replicação, pareado com a fita que servirá de molde para a síntese da fita descontínua. Na verdade, para cada fragmento de Okazaki a ser gerado será necessária a adição de um primer. E, assim como o DNA, o primer também tem um sentido 5’-3’ bem definido. Quem sintetiza o primer? Na natureza o primer é feito de RNA e é adicionado pela enzima primase, que trabalha junto com a DNA polimerase e com diversas outras enzimas no processo de replicação do DNA.

A figura 6a abaixo mostra as várias etapas da síntese de duas novas fitas de DNA a partir da fita dupla original, no modelo em que a replicação começaria na extremidade (errôneo: isso nunca acontece; mas serve para exemplificar as questões a que nos referimos acima).

 

   
Figura 6a: (Parte I) No modelo acima, em que a forquilha de replicação inicia-se na extremidade do DNA, há inicialmente a adição de um primer na extremidade da fita molde da esquerda (3´). Assim que a forquilha de replicação se abre o suficiente, pela ação da girase e da helicase e pelo progresso da replicação da fita contínua, um primer interno é colocado e começa a síntese da fita descontínuo, pelo primeiro fragmento de Okasaki. A fita contínua e os fragmentos de Okasaki são, na Escherichia coli, sintetizadas pela DNApol III. Os trechos fita simples devem ser protegidos de quebras mecânicas e da ação de DNAses pelas proteínas ligadores de fita simples (SSB). (Parte II) Quando a forquilha de replicação avança mais, outro fragmento de DNA é adicionado. (Parte III). Terminada a síntese do segundo fragmento, resta uma ponte fosfodiéster a ser completada na fita simples recém-sintetizada, mas que não pode ser feita porque a enzima ligase não une RNA (a extremidade 5´-P do primer do 1o. fragmento de Okazaki) a DNA (extremidade 3´-OH do fragmento de Okazaki novo recém sintetizado). Para que a ligase possa unir dois fragmentos de Okasaki consecutivos é indispensável que a DNApol I retire o primer de RNA e ressintetize o espaço com DNA

A consequência final deste mecanismo de adição de primers antes da extensão das fitas novas é que haverá trechos de RNA entre longos segmentos de DNA na fita descontínua. E mesmo na fita contínua haverá pelo menos um primer de RNA seguido de toda a fita feita com DNA. Será esta a situação final do DNA fita dupla replicado? É evidente que não. Heterohíbridos RNA-DNA não são estáveis. Eles têm que ser retirados do DNA maduro. Para isto entra em ação a atividade corretora da enzima DNA polimerase I (até agora vínhamos falando de uma DNA pol sem citar sua denominação completa, que é DNA pol III). A DNA pol I reconhece defeitos diversos no DNA, inclusive a presença de RNA, mesmo que pareado ao DNA (neste caso a base nitrogenada Timina é substituída pela Uracila). Através de uma atividade exonucleotídica 5’-3’, ela retira o primer.  Ao mesmo tempo, empregando a hidroxila livre da extremidade 3’ do fragmento de Okazaki já sintetizado e situado 5’ do sítio reparado, outra cópia da mesma molécula ressintetiza o espaço deixado, desta vez com DNA. Por fim a enzima ligase completa a ligação entre os fragmentos de Okazaki. A figura abaixo mostra um modelo de replicação mais completo do que os habitualmente representados nos livros. É preciso entender aqui que a forquilha não existe de fato, mas sim no contexto de uma replicação bidirecional, em que duas forquilhas, apontando em sentidos opostos, se abrem e permitem a replicação do DNA.

Figura 7: Representação da forquilha de replicação, onde estão mostradas as principais enzimas e cofatores que formam o complexo de replicação (replicossomo): DNApol III (duas moléculas), RNA primase e helicase. A helicase é uma topoisomerase, responsável pela abertura da forquilha. As duas DNA pol III mostradas trabalham de fato juntas, na mesma direção; para isto a fita de DNA que é replicada descontinuamente forma uma alça e a DNA pol III nesta fita periodicamente "larga" a fita e retoma o serviço num ponto mais interno. (figura extraída do livro The Cell: A molecular Approach, de J. Cooper, Sinauer Assoc. Co., disponível on-line no Bookshelf do NCBI)

Agora sim, estamos com a imagem completa! Não, leitor paciente. Há ainda diversas imprecisões do modelo que, para nossa sorte, não interferem negativamente em nosso estudo das modernas técnicas da genética molecular. Por isso as comentaremos apenas brevemente.

Ora, a primase não adiciona primers no início dos cromossomos lineares. E então, como se replicam as pontas dos cromossomos? Sabemos que cromossomos tem muitas origens de replicação, mas o problema da ponta sempre persiste. Se não é possível adicionar um primer, então as pontas dos cromossomos vão sendo encurtadas, porque não seria possível replicá-las. Isto de fato acontece: na fita descontínua, sintetizada a partir do molde de DNA fita simples parental, um primer é adicionado um pouco antes do final do molde (pela DNA primase), após a síntese do fragmento de Okazaki correspondente, o primer é retirado, sobrando um pequeno trecho a ser recomposto. Se isto não ocorrer, e de fato não ocorre, a fita simples de DNA será eliminada e o DNA ficará mais curto um pouco. Ao longo de múltiplas replicações a tendência seria desaparecer o cromossomo! Os eucariotos (que têm cromossomos lineares) possuem uma enzima, chamada telomerase, que adiciona uma seqüência de bases definida, repetindo muitas vezes esta operação, cada vez que detecta um encurtamento significativo da extremidade de um cromossomo. Neste processo a integridade do cromossomo é garantida. Por isso também as extremidades de todos os cromossomos de uma mesma espécie eucariota são iguais e formadas pelos telômeros.

Figura 8: Replicação telomérica: a figura identifica as reações envolvidas na formação de sequências ricas em G, que formam as extremidades dos cromossomas (telômeros). A fita incompleta é sempre a descontínua, recém sintetizada e iniciada num primer de RNA, já retirado na figura. Como indicado, a telomerase é um complexo RNA-proteína que têm um molde de RNA para a síntese de uma sequência de DNA rica em G. Estas repetições têm a sequência GGGTGG em Tetrahymena (um protozoário ciliado), GGGTTA em humanos e G1-3A em Saccharomyces. A telomerase apenas alonga a fita contínua, pela adição de um número variado de telômeros. A fita descontínua é então parcialmente completada pela DNA polimerase a, que tem a primase como uma de suas subunidades (figura baseada no livro Molecular Biology of the Cell , Alberts e cols., Garland Publ, também disponível no Bookshelf do NCBI).

Se este é um assunto que lhe interessa muito, leia mais sobre a telomerase aqui.

Outro ponto que geralmente não é mencionado nos modelos de replicação, e que tem uma importância relativa na compreensão de certas limitações das técnicas de genética molecular, é a atividade revisora da DNA polimerase III bacteriana (e das DNA pol em geral, sejam elas eucariotas ou procariotas). O que é e para que serve esta atividade? Na natureza existem formas alternativas das quatro bases nitrogenadas que formam o DNA, chamadas formas tautoméricas. A frequência com que estas bases ocorre é baixa, porém muitas ordens de grandeza acima da frequência de erros admissíveis no DNA (lembre-se que a adição de uma base errada na sequência de um gene é uma mutação, que pode ter consequências importantes para o portador do gene mutante). Cada vez que uma dessas bases tautoméricas é empregada, provoca um erro de pareamento. Se não for retirada antes da próxima replicação, uma mutação será introduzida no DNA. Por isso, as DNA pol (I,II e III, em Escherichia coli e muitos outros procariotos, a e b em eucariotos) têm a capacidade de rever, imediatamente após a adição, se o pareamento da base adicionada com a base da fita molde foi correto. Qualquer erro de pareamento é refletido pela alteração na estrutura da dupla hélice. Esta alteração deve fluir por um canal iônico da própria DNA pol. Se a hélice estiver alterada a DNA pol pára, volta na direção 3’-5’ despolimerizando a cadeia recém sintetizada e, após algumas dezenas ou até centenas de bases, recomeça o trabalho. Parece um processo pouco econômico, mas lembre-se que a integridade da informação genética está em jogo e, portanto, a conservação da espécie.

Há ainda na replicação do DNA um grupo de enzimas responsáveis pelo desenovelamento e separação das hélices do DNA, assim como pela separação das cadeias duplas formadas na replicação do DNA circular. Estas enzimas, coletivamente chamadas topoisomerases, são vitais para a replicação do DNA na natureza, mas não tem maior relevância para a tecnologia baseada na manipulação in vitro do DNA.

Embora o enfoque deste texto seja em mecanismos procariotos, devemos lembrar que nos eucariotos o mecanismo de replicação é essencialmente o mesmo. A fita contínua é replicada pela DNA polimerase d (delta) e a descontínua pela DNA pol e (epslon). Há, ao contrário dos DNAs procariotos, várias origens de replicação no DNA eucarioto, que são ativadas simultaneamente.

Para uma revisão recente sobre a replicação do DNA veja o artigo de B. Alberts em NATURE | VOL 421 | 23 JANUARY 2003, disponível aqui para download.

 

"Experimento" proposto:  corte uma folha de papel no sentido do comprimento e 4 tiras de igual largura e cole as 4 formando uma longa tira. É o seu DNA fita dupla. Faça umas 4 fitas destas. Em seguida pegue uma delas, dê meia volta numa das pontas e feche o círculo colando com fita adesiva. Estará formada a famosa cinta de Möbius. Com uma tesoura corte a fita no sentido do comprimento, como se estivesse dividindo o DNA, e veja o que acontece! Repita a operação com uma nova fita, desta vez dando duas meia voltas na ponta da fita e selando outra vez. Corte no sentido do comprimento e surpreenda-se com o que sairá. Repita a operação com uma volta e meia e com duas voltas. O que você conclui? Qual destas formas d unir um DNA circular não existe na natureza? Por que?

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