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**** texto da prova, roteiro para seminários e grupos formados - disponíveis em Notícias - TMB ****

 

 

Técnicas moleculares em biologia aplicadas ao diagnóstico

Esta disciplina tem 60 h (30T e 30P) e é oferecida como eletiva pelo Curso de Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas da UFPE. Para o roteiro deste semestre (1o. sem/2006), consulte Notícias para TMB.

 

A disciplina no 1o. semestre em que foi oferecida (2o. sem. 2005, ministrada em 2006) seguiu o roteiro abaixo. Para este ano procuraremos seguir o roteiro especificado em Programa.

 

Roteiro 2o. sem. 2005, ministrada em 2006

Parte A: 6 aulas baseadas no programa de Genética Molecular para Ciências Biológicas

Parte B

Aula 1: PCR

Aula 2: Desenho de primers

Aula 3: Outras técnicas moleculares

Aula 4: Ferramentas de data-mining on-line para busca de alvos de PCR (aula dividida em 3 partes, acessadas ao final de cada parte anterior)

 

Programação 2005 (2o. sem) de seminários

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Aula 1: PCR

Esta aula foi baseada no capítulo 2 de nosso livro-texto.

O capítulo comenta várias técnicas, entre elas o PCR. Fala também de forma breve sobre a extração de DNA e de RNA. Nesta aula complementamos em sala alguns pontos que julgamos importantes e que estavam pouco explorados no livro ou mesmo não foram comentados.

1. Extração de DNA

Durante toda a primeira parte do século XX as proteínas tiveram muito mais atenção da ciência do que os ácidos nucléicos. Como censequência, os métodos de extração, purificação e análise de proteínas avançaram muito mais do que os equivalentes para DNA. A partir da década de 60 esta situação foi lentamente se modificando até que, ao final do século, ficou muito mais fácil extrair, purificar e analisar DNA do que proteína. Parecia um caminho sem volta, mas a proteômica aos poucos vai igualando este placar outra vez, Esta, entretanto, é outra história, que vamos contar em outras aulas.

A extração clássica de DNA envolve os passos descritos no livro: lise, desproteinização e concentração do DNA. Devemos manter em mente que o DNA é extremamente solúvel em água, muito mais do que a maioria das proteínas e mesmo de muitos açúcares. Mas mesmo antes que se possa proceder à primeira destas etapas, é preciso considerar o material que nos vai doar as células ou, ao menos, o DNA (já fora delas),

1.1 Tipos de material fonte e manipulações prévias à extração

Há uma ampla gama de material do qual poderemos ter interesse em extrair o DNA, como mostrado na tabela abaixo. Uns são duros, outros moles ou líquidos, uns abundantes, outros escassos, uns fáceis de extrair o DNA e outros positivamente dificílimos.

Tabela I. Alguns exemplos de fontes de DNA. Podem ser duras ou friáveis e mesmo líquidas.

material duro

material mole ou fluido

osso

ascite

tumor sólido

aspirado de medula

coral

tecidos moles em geral

esponjas marinhas

sangue

coprólitos

água de reservatórios naturais ou artificiais

 

O material duro geralmente é fragmentado antes da extração por maceração, o que pode ser feito de muitas formas distintas: com um pistilo e uma cuba, com um ralador, com alicate, etc. Em geral o material a ser macerado e os instrumentos são todos congelados ou pelo menos mantidos em gelo durante o trabalho, embora o DNA seja muito resistente às temperaturas usuais, O problema é que a maceração gera um calor local surpreendente, que não se percebe facilmente.

 

Tecidos moles e tumores devem ser congelados em nitrogênio líquido ou gelo seco e macerados como o material duro. Sangue, ascite, água e qualquer outro material que contenha o DNA em suspensão celular devem ser centrifugados para a coleta das células e fragmentos de tecidos. O precipitado (ou pellet) deve ser ressuspenso num tampão adequado e passado por um homogeneizador Potter, que consiste de um tubo onde passa muito justo um êmbolo de vidro sinterizado ligado a uma haste. O material líquido é obrigado, pelo movimento do êmbolo, a subir e descer pelo tudo, entre a parede do tubo e a do êmbolo. Nesta passagem as células são rompidas. Dependendo do ajuste entre o êmbolo e o tubo, até mesmo as organelas serão rompidas. A figurinha ao lado mostra três tubos Potter e seus êmbolos. Em geral o material que vai ser homogeneizado num Potter é mantido gelado e o próprio Potter fica imerso num banho de gelo. Este procedimento é especialmente importante na extração do RNA. A figura abaixo mostra um Potter num banho de gelo.

Figura 1. Homogeneizador Potter num banho de gelo. A suspensão de células é obrigada a subir e descer pelo êmbolo quando este é gentilmente movimentado ao longo do tubo.

 

Simplificações são possíveis na etapa de preparação prévia do material, como passar a suspensão de células repetidas vezes por uma agulha fina, empurrando a suspensão com uma seringa. Ainda mais simples, pode-se ferver o material e usar o sobrenadante como fonte de DNA.

 

 

1.2 Lise química

 

Esta etapa está bem detalhada no texto do livro. Lembramos apenas alguns pontos suplementares:

algumas células têm uma parede celular rígida (como os vegetais) ou estão de alguma forma protegidas pro material duro (como no caso das esponjas). Em alguns casos podemos empregar uma enzima específica para estas paredes rígidas (lisozimas, quitinases, proteinases, etc.), em outros casos temos que empregar o Potter ou mesmo a prensa francesa. Outra forma muito eficiente de lise e a quebra por ultra-som.

 

Se a lise é feita num tubo de ensaio (um micro-tubo tipo eppendorf, por exemplo), o DNA liberado da célula vai para o sobrenadante. A manipulação d solução com as ponteiras usuais das micropipetas tendem a quebrar o DMA em grandes fragmentos, de 100 mil a 500 mil bases. Estes grandes fragmentos são úteis para quase todas as técnicas de análise de DMA. Apenas para a análise de tamanhos de cromossomos temos que ser muito cuidadosos na extração, mas isto não será tema de nossa disciplina.

 

O aquecimento do material a ser lisado ajuda na lise, mas se for acima de 65 oC vai levar à desnaturação do DNA cromossômicos (que está em grandes fragmentos, como dito acima). O DNA desnaturado é pouco solúvel e tenderá a precipitar na etapa de desproteinização, o que vai forçar a perda de material para análise. O aquecimento, contudo, é usado quando queremos extrair DNA plasmidial de uma célula, e nos ver livres do DNA cromossômico.

 

1.3 Desproteinização

 

Classicamente a retirada de proteínas é feita com o uso do fenol. Este solvente orgânico tem um coeficiente de partição muito elevado para proteínas, isto é, quando misturado numa solução aquosa contendo proteínas, o feno sequestra as proteínas em sua fase e, à medida em que vai se separando da água, leva as proteínas consigo. A água fica no sobrenadante e as proteínas ficam retidas no fenol, no fundo do tubo. Mas normalmente a etapa de extração com fenol é precedida de uma outra, mais simples, em que as proteínas menos solúveis são retiradas pela adição de sal à suspensão. Este é o clássico "salting out" da bioquímica, que também é o princípio da conservação de carnes por salmouras, etc. Após a adição do sal (em geral acetato de amônia) a suspensão é centrifugada e o pellet descartado. No sobrenadante há, agora menos proteína e já se pode extrair o que ficou com fenol.

 

A desproteinização está bem descrita no livro e não vamos dar maior ênfase a ela aqui.

 

 

1.4 Concentração do DNA

 

Uma vez que nos vimos livres das proteínas (e com elas outras moléculas, que vão embora no salting out), sobra no sobrenadante o DNA. Para concentrar o DNA geralmente precipitamos o dito com álcool. Para isso adicionamos álcool 100% gelado ao mesmo volume de solução de DNA e centrifugamos o tubo a 13.000 por 5 minutos. Após o descarte do álcool pode-se lavar gentilmente o pellet com àlcool a 70% e deixar secar o material. Uma vez seco, o DNA pode ser re-dissolvido num volume adequado de água ou de tampão (em geral Tris-EDTA). Há outros detalhes e comentários importantes no texto do livro.

 

1.5 Alternativas ao fenol

 

Hoje em dia há um grande número de kits comerciais que empregam resinas e outros produtos para a purificação rápida de DNA. Em nossas mãos o DNAzol é um dos mais eficientes: a quantidade de DNA obtida por mg de tecido não é muito grande, mas a pureza é satisfatória para a maioria das aplicações. Há também uma variante do DNAzol para extração de DNA do sangue, o BloodDNAzol, e outra para extração de RNA (o RNAzol). Estes kits são baseados nas propriedades caotrópicas da tioguanidina na concentração de 6M ou maior: neste produto os componentes celulares se desagregam, as enzimas páram de atuar e o material se torna estável por longo tempo à temperatura ambiente. É a forma ideal de transportar amostras para extração e análise posterior

 

2. Observações sobre o PCR

A técnica de PCR já foi discutida nas aulas anteriores (veja Aulas de Genética Molecular no site www.biolmol.cjb.net) e vamos aqui apenas enfatizar certos pontos.

2.1 Tubos, placas e evaporação

 

Os termocicladores de hoje, também chamados máquinas de PCR ou simplemente PCRs, trabalham com tubos diminutos de plástico (para volumes de, no máximo, 200 ml, mas usualmente levam reações com 10 a 50 ml) ou com microplacas com 96 poços, cada um para até 200 ml. É claro que uma reação feita com 10 ou 50 microlitros, se aquecida repetidamente como pede uma reação de PCR, vai evaporar completamente. Para evitar isso pode-se colocar uma pequena gota de óleo mineral sobre a reação, em cada tubo, ou selar a placa com um filme plástico muito aderente. Ultimamente a indústria vende tubos com uma tampa especial que evita a evaporação e também um selo plástico formado por 96 pequenas tampas que pode ser colocado sobre a placa e mantido apertado contra ela pela tampa do termociclador, o que também evita a evaporação.

 

 

2.2 Falta de energia

 

Um problema crítico no PCR é que ele não deve ser interrompido e retomado algum tempo depois. Assim, falta de energia é sempre uma dor de cabeça para o experimentador. idealmente, a máquina de PCR deve estar conectada a um no-break, como um computador.

 

2.3 Rampas de aquecimento e resfriamento

 

Quanto mais rápida seja a mudança de temperatura entre os pontos escolhidos para uma reação de PCR (usualmente 96, 56 e 72 oC). melhor será o resultado do PCR: menos bandas espúrias, mais nitidez da banda esperada, etc. Entretanto, aquecer rapidamente não ´pe tão simples, e esfriar rapidamente é ainda mais complicado. As rampas de esfriamento e aquecimento mais íngremes são as melhores. O sistema Peltier, pelo qual a passagem de corrente elétrica num bi-mental aquece ou esfria uma placa, é muito simples e confiável, mas não dá rampas muito íngremes. Os melhores termocicladores não usam este princípio, mas são muito caros. Então, o comprador deve estar atento ao resultado que quer atingir e aos custos que deve tolerar.

 

A figura ao lado mostra duas rampas de inclinação diferente para um termociclador hipotético.

 

Outro ponto importante: os termocicladores não servem só para fazer PCR, mas podem ser usados para um grande número de outras aplicações no laboratório.

 

 

 

 

2.4 Hot start

 

Quando se começa um PCR, a enzima Taq polimerase vai atuar ainda durante a rampa de aquecimento, antes que os DNAs estejam devidamente desnaturados a 96 oC. Isto pode dar umas bandas extras no PCR e borrões feios no gel. Para evitar isso pode-se pipetar a Taq no tubo quando a mistura já alcançou a temperatura de desnaturação. Há hoje em dia resinas especiais que se desmancham quando a temperatura é adequada e liberam a Taq. Começar a ação da Taq quando a temperatura é alta é conhecido como hot start.

 

2.5 PCR touch down

 

No livro há um item sobre o uso desta técnica para determinar a melhor temperatura de pareamento (anelamento ou annealing). Mas hoje em dia é muito mais corriqueiro o uso de termocicladores com gradiente de temperatura. Pode-se regular a placa aquecedora para ter à sua esquerda uma temperatura e à direita outra, vários graus maior ou menor. O resultado é que todas as temperaturas intermediárias estarão distribuídas nos poços ao longo da placa. Esta forma é muito mais eficiente para determinar a melhor temperatura de pareamento, ou de extensão.

 

2.6 PCR em tempo real

 

Muitas vezes as pessoas confundem  a  nomenclatura RT-PCR, porque de fato ela tem dois significados. Um que está no livro, é reverse-transcriptase-PCR, um PCR que começa pela ação da transcriptase reversa, para transformar um RNA num cDNA. Depois a reação continua como um PCR convencional.  O outro significado é real time PCR, um sistema moderno de PCR, quantitativo, em que a reação não é visualisada num gel e sim medida pela fluorescência emitida no sistema. esta técnica está breveente descrita e comentada no final da aula de PCR na página de aulas de genética molecular deste site.

 

 

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Aula 2: Desenho de primers

 

Além da apresentação do Prof. Kido, há também aqui d o site do programa que foi empregado na aula parta desenho de primers (software on-lineprimer3).

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

 

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Aula 3: Outras técnicas moleculares e aplicações não mencionadas na aula 1

O PCR foi inventado no meio da década e 80 e só veio encontrar uma ampla aplicação, inclusive comercial, na década de 90. Antes disso, outras técnicas moleculares dominavam o mercado. Como eram todas menos sensíveis que o PCR, suas aplicações eram, de certa forma, mais limitadas. Duas delas se destacavam e se complementavam: o uso de sondas de DNA e o uso de enzimas de restrição.  A união das duas técnicas ficou conhecida como RFLP (restriction fragment lenght polymorphism, polimorfismo dos comprimentos de fragmentos de restrição). As sondas e o RFLP continuam tendo grande aplicação, inclusive no diagnóstico laboratorial, apesar do PCR. A seguir comentaremos brevemente o desenvolvimento de sondas e suas aplicações e o RFLP.

1. Sondas de DNA e hibridização com DNA ou RNA

Uma sonda de DNA é um DNA fita simples, de tamanho pequeno (em geral ente 50 e 300 bases), que está marcado com uma susbtância radiativa ou conjugado a um produto qualquer que permita sua visualização nuam etapa final do ensaio de hibridização. Assim, o objetivo de uma sonda é encontrar (hibridizar com) um trecho de um DNA para o qual ela seja pelo menos parcialmente complementar, e permitir a posterior localização de sua presença num ensaio qualquer: num Southern blot (como uma banda), num dot assay (como um ponto), num ELISA (como susbtrato colorido), etc. Veremos inicialmente, de forma muito breve, como é possível produzir uma sonda com uma sequência conhecida, e de tamanho determinado.

Há várias formas de se produzir uma sonda e as que vamos descrever são apenas duas delas, talvez as mais frequentemente empregadas. Para uma revisão mais completa deste assunto, favor consultar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458 , que mostra o capítulo de um dos nossos livros da bibliografia (neste caso, em inglês), o Genética Molecular Humana, de Strachan e Reed.

1.1 Preparação de sondas de DNA

As sondas de DNA vão servir, em geral, para vários tipos de testes de hibridização. Estes testes têm, em comum, o objetivo de identificar visualmente uma sequencia de ácido nucleico (em geral DNA, mas também am alguns casos RNA) que está em mistura com muitas outras. As sondas de DNA podem ser feitas como fitas duplas ou fitas simples, mas para funcionarem nos ensaios de hibridização, elas devem ser desnaturadas, numa primeira etapa, se forem feitas como fitas duplas.

As sondas convencionais são feitas de DNA clonado num plasmídeo. A partir deste plasmídeo é possível produzir fitas simples de DNA copiadas do trecho clonado, como primeiro passo para a produção de sondas fitas simples. Pode-se também amplificar o DNA clonado por PCR (empregando primers que hibridizam com as regiões flanqueadores do inserto no plasmídeo). Estas duas formas básicas de iniciar a produção de sondas fita simples ou fita dupla estão mostradas na figura 1 abaixo: Um pedaço de DNA fita dupla (em segmento de um gene, uma região com repetições, uma região telomérica, etc.) pode ser clonado num plasmídeo e a partir desta construção pode-se produzir uma fita simples (por extensão de um primer, à esquerda, como na parte A da figura 1) ou por PCR, à direita. Pode-se, neste processo, incorporar, por exemplo, um precursor radioativo de uma das bases nitrogenadas, e a fita simples ou dupla já será produzida marcada e será, portanto, uma sonda. Por outro lado, pode-se marcar o DNA fita simples ou fita dupla recém produzido pela conjugação com uma enzima ou biotina (parte B da figura 1 ) ou se pode ainda empregar um primer previamente "marcado" com material radioativo ou fluorescente (parte C da figura 1 ). Há várias outras possibilidades de se marcar uma sonda, mas remetemos o leitor ao link já comentado anteriormente ou a manuais específicos de laboratório. Quanto ao tamanho da sonda, ela pode ter umas poucas centenas de bases, mas pode, em alguns casos, ser muito longa, com mais de 10.000 bases. Tudo dependerá do que queremos identificar na nossa posterior hibridação.

Figura 1: A - Um segmento de DNA (em vermelho) pode ser clonado num plasmídeo (em amarelo) e a partir de posições específicas no plasmídeo pode-se estender uma fita simples (com o auxílio de uma DNA polimerase) ou produzir uma fita dupla (por PCR). Se precursores de bases (dNTPs) marados forem empregados neste processo, a fita simples ou dupla já sai marcada, sendo, poranto, uma sonda. B - uma fita previamente produzida pode ser "marcada" pela conjugação de algumas bases com uma enzima ou outra molécula apropriada (biotina, por exemplo). Estas moléculas auxiliarão na visualização posterior da sonda, no ensaio de hibridização. C - A marcação da sonda pode ser feita pelo uso de um primer previamente marcado.

Uma alternativa para a produção de sondas de pequeno tamanho é a síntese de oligonucleotídeos, isto é, pequenas sequências de DNA fita simples, neste caso, marcadas com radiatividade ou outro tipo qualquer de marcação. Os oligonucleotídeos têm em geral menos de 50 bases e a hibridização deve ser feita em condições especiais para que estas sondas possam ficar aderidas ao DNA alvo ao fim do ensaio de hibridização.

Os marcadores de sondas podem ser, como dito anteriormente, de origem radioativa ou não. Tradicionalmente, a marcação radioativa é feita pela incorporação de nucleotídeos contendo radioisótopos (32P, 33P, 35S ou 3H), que pode ser detectada de várias formas, sendo a mais usual a auto-radiografia (exposição do material - gel, membrana de blot, etc - a um filme de raio X). 

As marcações não radioativas, pela conjugação de uma molécula específica a várias bases da cadeia de DNA, são em geral de três tipos:

Figura 2: A - A conjugação de um fluorocromo (fluoresceína, que brilha verde no microscópio) ou rodamina (que tem uma cor avermelhada) é feita através de um braço espaçador ao nucleotídeo de uma cadeia ou diretamente oa precursor de bases trifosfatado (como na figura). B - A amostra cujo DNA foi reconhecido com a sonda marcada com fluoresceína é observada ao microscópio de fluorescência por epi-iluminação. O comprimento de luz adequado para a excitação do fluorocromo é selecionado pelo filtro de excitação, a luz reflete no espelho dicróico e desce pela objetiva até a amostra. O flouorocromo excitado emite a radiação verde característica que é direcionada pela objetiva de volta ao espelho, mas desta vez a luz o atravessa e vai, através da ocular, ao olho do observador. Fonte da imagem: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476

 

1.2 Princípios de hibridização de ácidos nucléicos

A hibridização de ácidos nucléicos pressupõe a mistura de fitas simples de DNA de fontes distintas. A sonda é usualmente composta de um conjunto de moléculas idênticas de DNA, marcadas como discutido acima. O DNA alvo pode ser composto de fragmentos de genoma, DNA previamente submetido a digestão por enzimas de restrição, RNA mensageiro e ainda muitas outras fontes de ácidos nucléicos. A fonte de DNA alvo tem, em geral, uma natureza heterogênea, isto é, muitas diferentes sequências de bases estarão presentes nos fragmentos de DNA oferecidos à análise.

Se o DNA alvo ou a sonda (ou ambos) são DNA fita dupla, é preciso separar as duas fitas antes de iniciar a hibridização, o que é geralmente obtido por aquecimento ou por tratamento com tampão muito alcalino. Quando se restauram as condições adequadas para o pareamento de bases, as fitas voltam a parear. A sonda pode então parear com sua região de complementariedade no DNA alvo. É claro que, se a sonda era originalmente fita dupla, ela tenderá a formar de novo a fita dupla, assim como o DNA alvo voltará a formar uma dupla fita, se originalmente ele estava nesta forma no ensaio. Mas o que interessa para o ensaio é a hibridização da sonda com o DNA alvo. Em geral o DNA alvo está aderido a um suporte, enquanto a sonda está na fase líquida, o que permite, por simples lavagem, retirar toda a sonda que não pareou com o DNA alvo ao final do ensaio, e revelar o resultado.

A temperatura de desnaturação dos ácidos nucléicos depende da composição de bases do DNA: quanto maior o conteúdo CG maior a temperatura necessária para a desnaturação. A temperatura em que 50% das moléculas de DNA se desnaturam (chamada Tm), para o genoma humano (que tem perto de 40% de C+C) é de 87 oC. Então, quando a desnaturação é feita pelo aumento de temperatura, classicamente empregamos 94 oC. Mas a temperatura de desnaturação também determina a melhor temperatura de pareamento (ou anelamento, como é designado o processo no nosso livro-texto de Rossetti e cols.). Geralmente ela é 25 oC menor que a de desnaturação. Então, temperaturas de hibridização entre 56 e 64 oC são comuns. Se descermos demais a temperatura de hibridização (pareamento ou anelamento) há sempre o risco, como no PCR, de provocarmos pareamentos sem sentido, ruins, que vão atrapalhar nossa análise dos resultados, posteriormente.

Depois que o pareamento é feito, é preciso lavar o excesso de sonda, que não pareou com o DNA alvo. Isso pode ser feito com o tampão de lavagem a uma temperatura mais alta do que a ambiente. Esta temperatura mais alta (em geral 37 a 45 oC) cria uma condição de estringência (de rigor) mais forte, e lava embora o que não estiver muito bem preso no suporte onde está preso o DNA alvo.

Um dos fatores que vai determinar se a sonda fica bem aderida ao DNA alvo é o seu tamanho. Outro fator é a porcentagem de identidade (complementariedade) entre a sonda e o DNA alvo. Com a prática (e a leitura de manuais específicos) o experimentador vai se familiarizando com estas variáveis do ensaio de hibridização. Vários outros fatores influenciam na reação de hibridização e não cabe aqui uma discussão mais completa.

 

1.3 Ensaios de hibridização de ácidos nucléicos

A imobilização do DNA alvo num suporte qualquer, em geral uma membrana de nylon ou uma lâmina de vidro, foi a forma encontrada para, ao mesmo tempo, aumentar muito a concentração de DNA alvo no ensaio e facilitar as etapas de lavagem da sonda não aderida ao DNA alvo. Praticamente todos os ensaios de hibridização são, assim heterogêneos, isto é, uma parte dos reagentes fica na fase sólida (a membrana) e outra na fase líquida (o tampão).  Nos últimos anos a inversão dos elementos do suporte passou a ser adotada em ensaios de alto desempenho (high throughput). A tabela abaixo mostra os vários ensaios mais comumente empregados em laboratórios de pesquisa e de serviços no mundo todo.

 

Tabela I - Ensaios padrão e ensaios reversos mais adotados em laboratórios de pesquisa e serviços no mundo. Baseado em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.table.499

Ensaios padrão

Sonda marcada em solução

 DNA alvo não marcado ligado a suporte sólido

Dot-blot

Qualquer DNA ou RNA marcados, mas usualmente um oligonucleotídeo

Populações complexas de DNA ou RNA, sem prévio fracionamento por tamanho, mas pipetadas diretamente sobre a membrana, formando pequenos pontos (dots)

Southern blot

 Qualquer

 Geralmente DNA genômico complexo (mas podem ser clones individuais de DNA), digerido com enzimas de restrição, fracionado por tamanho (em eletroforese), e transferido para membrana

Northern blot

Qualquer

 População complexa de RNA (p. ex.: RNA celular total ou mRNA), fracionada por tamanho (em eletroforese) e transferida para uma membrana

Hibridização in situ de cromossomo

Geralmente um clone genômico marcado

DNA nos cromossomos (em geral em metáfase) de células lisadas numa lâmina de microscópio

Hibridização in situ de tecido

Geralmente uma ribo-sonda anti-sense (isto é, complementar à fita de RNA do tecido) ou ainda um oligonucleotídeo

RNA dentro de células de tecidos, em secções fixadas numa lâmina de microscópio

Blot de colônia 

Qualquer

Colônias de bactérias ou células, obtidas por plaqueamento em ágar, e transferidas para uma membrana

Blot de plaque viral (ou fágica)

Qualquer

Plaques de lise fágica em tapete de bactérias formado em placa de ágar nutriente, transferidas para membrana.

Ensaio de hibridização de grid de colônias

Qualquer

Clones de bactérias transferidos por robô, de forma geometricamente ordenada, em membrana. Pode ser feito manualmente, em escala menor.

 Ensaios reversos

DNA alvo marcado em solução

 Sondas não marcadas ligadas a suporte sólido

Dot-blot reverso

DNA complexo

Oligonucleotideos pipetados em pontos sobre uma membrane

DNA microarray

DNA complexo

Clones de DNA aplicados em micro-pontos sobre uma membrana com auxílio de um robô

Microarray de oligonucleotídeos

DNA complexo

Oligonucleotideos sintetizados diretamente sobre lâmina de vidro, e, micro-pontos ordenados.

 

Muitas das técnicas acima podem encontrar aplicação imediata em diagnóstico.

No Dot blot podemos pipetar numa membrana os DNAs extraídos de tecidos de pacientes com uma suposta infecção por um fungo, por exemplo, e em seguida hibridizarmos o material com uma sonda representando uma região gênica exclusiva (característica) deste fungo.  Muitos pacientes podem ser investigados, assim, ao mesmo tempo. A limitação é a quantidade de DNA do fungo presente no ensaio, que não deve ser tão pequena que, frente ao enorme excesso de DNA do próprio paciente, não possa ser localizada pela sonda.

A hibridização de cromossomos, também chamada FISH, pode ser aplicada à identificação de alterações de sequências nos cromossomos que não levam a mudanças conformacionais detectáveis pelas técnicas de bandeamento convencionais. É, assim, uma aliada do diangóstico genético humano ou de animais, além de ter inúmeras aplicações em pesquisa.

A hibridização in situ de tecidos se assemelha ao FISH, mas o alvo é em geral o RNA das células, e não um cromossomo individualizado na metáfase. Ela pode ser aplicada ao estudo da expressão de certos genes que podem estar ligados, por exemplo, ao câncer. Mas também pode ser aplicada à detecção de RNA viral ou de um agente infeccioso qualquer no tecido de um paciente.

O Southern blot (que ganhou este nome por ter sido inventado por um pesquisador de nome Southern) também encontrou muitas aplicações no diagnóstico. Estranhamente, não é uma técnica trivial, mas foi de tal forma aprimorada e padronizada pelas várias empress fornecedoras de insumos que alcançou considerável uso na área diagnóstico, com especial aplicação na detecção de doenças genéticas e no diagnóstico de paternidade. Vamos focalizar um pouco mais a atenção sobre este ensaio e deixaremos os demais para outra disciplina, que será oferecida em breve no CCB (UFPE) pelo Gentrop (Departamento de Genética). Para uma leitura on-line (em inglês) deste assunto, recomendamos o livro texto de Genética Molecular Humana - Strachan e Reed, pelo link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.

A figura abaixo sumariza os principais passos do Southern blot aplicado a um DNA pré-digerido com enzimas de restrição. Esta associação técnica é conhecid como RFLP e envolve a purificação do DNA alvo (de um paciente, por exemplo), sua digestão com enzimas de restrição, a separação dos fragmentos gerados e a transferência destes fragmentos para uma membrana de nylon ou material análogo. Esta membrana será então incubada com a sonda de DNA marcada, que deverá ser dirigida contra o segmento de DNA que se tem interesse em estudar.  Vão aparecer bandas correspondentes a fagmentos de restrição do DNA original que têm sequências total ou parcialmente complementares à sonda.

 

Figura 3: Esquema representativo da técnica conhecida como RAPD, que é de fato a aplicação do Souther blot a um conjunto de amostras de DNA pré-digeridas com enzima de restrição. A figura é auto-explicativa. Ressaltamos apenas o resultado da eletroforese, que dá um número muito grande de bandas com diferentes pesos moleculares  e que não podem ser resolvidas no gel, que mostra apenas um rastro (smear) no lugar das bandas. As bandas só surgirão pela identificação destas pela sonda.

Se a sonda tiver um número razoável de bases (suponhamos, 1000 b), ela poderá ser capaz de identificar alterações ocorridas no padrão de fragmentação do DNA pelas enzimas de restrição, toda vez que um sítio de restrição dentro da região de reconhecimento da sonda o próximo a ela for criado ou desaparecer, devido a uma mutação. Isto vai provocar o aparecimento ou desaparecimento de uma banda no resultado final mostrado na figura abaixo, indicando que houve alteração na sequência de DNA.

Figura 4: - A digestão de um DNA genômico com enzimas de restrição gera um número muito elevado de bandas. Mas com o uso de uma sonda dirigida a uma única região do genoma (um gene ou região intergênica de interesse) é possível estudar apenas um pequeno trecho. A figura mostra à esquerda e à direita dois segmentos de DNA idênticos exceto pela presença de uma mutação que elimina um sítio de restrição para a enzima BamH1 (GGATCC) do segmento em estudo; Os sítios de restrição que ainda permanecem no DNA mutado geram um segmento de 9 kpb, que será identificado pela sonda no Southern blot, enquanto no DNA selvagem (não mutante) o mesmo fregmanto será cortado em dois pela enzima de restrição, gerando dois fragmentos de 4 e 5 kpb. Apenas um deles (o de 4 kpb) será reconhecido, já que o outro não contém região de homologia com a sonda.

 

Quando o RFPL é aplicado ao estudo de diferenças entre fragmentos de restrição contendo regiões repetidas, que não fazem parte de genes, ele pode se tornar uma ferramenta para identificar indivíduos e apontar relações de cruzamento entre casais. Isto se deve ao fato de que estar regiões ricas em repetições, não sendo genes, divergem muito entre indivíduos. Estas repetições, chamadas VNTR, poderiam, em princípio, ter um número muito variado de repetições, mas na prática o termo é guardado para arranjos de tamanho moderado, contendo repetições de 5 a 64 pb. estas repetições são conhecidas como DNA mini-satélite hipervariável, ao contrário das repetições de um a  4 nucleotídeos, que são chamadas micro-satélites.

Cada um de nós carrega, em princípio, dois alelos para quaisquer destas repetições, uma trazida do genoma de nossas mães e outra de nossos pais. Quando transmitimos à progênie estas "marcas", uma delas apenas passará à F1, que receberá a outra do outro parceiro (ou parceira) do cruzamento. Então, estudando estas regiões, que são polimórficas em tamanho, poderemos inferir hereditariedade e individualidade. A figura abaixo, adaptada de um excelente portal sobre biologia molecular (http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/), mostra como poderiam aparecer estes fragmentos de restrição reconhecidos por uma sonda, numa análise de relação de parentesco.

Figura 5: - O RFLP para paternidade gera um número de bandas grande (simplificado na figura), fruto da digestão do DNA genômico do indivíduo com enzimas de restrição e do reconhecimento de múltiplos fragmentos pela sonda dirigida contra a região repetida de interesse. Neste esquema as cores das bandas maternas e paternas correspondem às cores de seus ovócito e espermatozóide. D1, filha do casal, tem 2 bandas maternas, sendo as restantes necessariamente paternas. D2, filha de um primeiro casamento da mãe, tem 3 bandas maternas mas as bandas paternas (em vermelho) não coincidem todas elas com as esperadas no atual marido (uma pequena diferença de migração é suficiente para diferenciar duas bandas). S1, filho do casal, tem duas bandas maternas e as 3 esperadas bandas paternas. S2, filho adotivo, tem bandas que não correspondem nem à mãe nem ao pai (embora possa haver algumas coincidências). Na prática, o RFLP não tem cores distintas para as bandas materna e paterna, o que faz com que a distinção seja baseada exclusivamente na posição da banda no gel (migração).

Fonte: http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/DNAfingerprint/

Como as bandas que aparecem na digestão do DNA de um indivíduo são numerosas, é relativamente comum que dois indivíduos quaisquer, quando comparados, mostrem ao menos uma banda diferente entre si. Mas a variedade de padrões de banda não é infinita e numa composição de bandas, no caso de paternidade, como a descrita acima (Fig. 5), pode haver coincidência entre as bandas  do suposto pai e do filho, sem que este seja, de fato, gerado por aquele. É preciso lançar mão de testes estatísticos, que avaliam a probabilidade de que cada banda observada esteja presente uma vez num ensaio qualquer. As frequências destas bandas correspondem às frequências alélicas que aprendemos, quando estudamos genes. Há tabelas sobre a frequência de cada banda e uma estatística rebuscada para analisar os resultados, e recomendamos aos interessados que procurem o livro-texto de Strachan e Reed e consultem o site mencionado na legenda da figura.

Na prática, o RFLP não tem cores distintas para as bandas materna e paterna, o que faz com que a distinção seja baseada exclusivamente na posição da banda no gel (migração). Um RFLP precisa, assim como outras técnicas onde muitas bandas são geradas numa eletroforese, de uma regularidade grande da corrida eletroforética, e dá para ver que isso nem sempre é alcançado (Figura ao lado)

Figura 6: - RFLP real. Veja a distorção das faixas (lanes) de eletroforese, tornando difícil identificar com precisão a posição relativa de uma banda e outra entre colunas não adjacentes.

O mesmo princípio descrito acima pode ser aplicado para os testes de individualidade empregados nos casos de criminalística e genética forense (em geral a identificação de paternidade é também um tema da genética forense).

Uma variante mais moderna deste ensaio, e que não usa a etapa de Southern blot e sim a amplificação inicial de um trecho do genoma (com as repetições a serem estudadas), tem sido oferecida como kit e empregada em laboratórios. Neste caso, um trecho do genoma é amplificado por PCR. O produto do PCR é aplicado ao gel. O resultado está ilustrado na figura abaixo, para a identificação de um suspeito de um crime.

Figura 7: Resultado de uma investigação de um crime (estupro). O DNA da vítima, dos suspeitos, do namorado e do material colhido na vagina (evidência ou corpo de delito) foi obtido. Um DNA controle também é empregado no ensaio. As bandas obtidas do suspeito 1 coincidem com as obtidas do esperma do corpo de delito. As bandas obtidas do DNA das células da mulher, obtidas em mistura com o esperma, coincidem com as bandas da vítima (de fato, o DNA é da vítima).

 

Pela inspeção simples da imagem acima fica evidente que o padrão de bandas com esta variante da técnica (que está mais detalhadamente descrita na página da aula 7 para Genética Molecular - C. Biológicas) é bem mais simples do que o do RAPD. Geralmente só são discernidas duas bandas, correspondentes aos dois alelos com repetições nos cromossomos homólogos do indivíduo.

 

2. Outras técnicas moleculares

Ainda vamos pensar o que virá aqui, o que foi comentado em aula foi o PCR em tempo real, mas este já está revisto nas aulas de Genética Molecular de C. Biológicas.