Base Molecular das Doenças Genéticas

Uma doença molecular é aquela na qual o evento primário causador doença é uma mutação, seja herdada ou adquirida. Uma doença genética (e molecular) ocorre quando uma alteração molecular de um gene essencial a quantidade, a função, ou ambas, dos produtos gênicos (mRNA e proteína). Os distúrbios monogênicos quase sempre resultam de mutações que alteram a função da proteína. As exceções são as mutações no DNA mitocondrial, que alteram as funções dos tRNAs mitocondriais (lembre-se que o genoma da mitocôndria tem apenas 37 genes, dos quais 22 são genes para tRNAs, como mostrado na aula sobre organização do genoma humano, item 7). Estas mutações levam a graves distúrbios, que afetam os músculos e o cérebro.

Embora seja condição primária para a compreensão da patologia da doença, o conhecimento da alteração bioquímica decorrente da alteração genética nem sempre conduz diretamente à compreensão dos mecanismos da patogênese. de fato, embora mutações tenham sido identificadas em mais de 1000 das quase 4.500 doenças genéticas monogênicas conhecidas, o fato é que a fisiopatologia não é conhecida completamente para nenhuma delas. Entretanto, o avanço tem sido grande nos últimos anos. Devemos nos lembrar aqui que a primeira doença genética cujo mecanismo molecular foi esclarecido foi a anemia falciforme, estudada por Linus Pauling em 1949. Portanto, os avanças foram todos essencialmente obtidos na segunda metade do século XX. espera-se uma enorme aceleração das descobertas, com o fim do Projeto Genoma Humano e com a introdução de novas técnicas de estudo de grande quantidades de genes e proteínas.

Neste capítulo vamos tratar de vários distúrbios genéticos, mas deixaremos as hemoglobinopatias para um capítulo à parte.

Os quatro efeitos possíveis são esquematicamente representados na figura abaixo. Podemos listá-los assim:

Os três últimos efeitos, embora menos comuns, são causa de importantes doenças genéticas.

Figura 1: Esquema geral dos mecanismos pelos quais as mutações que causam doenças produzem a patologia associada.

As mutações em regiões codificantes resultam e proteínas estruturalmente anormais, que têm umaperda ou um ganho de função, ou uma nova propriedade. As mutações em sequências não codificantes em geral são de dois tipos: as que alteram a estabilidade e a recomposição (turn-over) do mRNA e as que alteram elementos reguladores ou mudam a dosagem gênica. As mutações nos elementos reguladores alteram a abundância do mRNA ou a época ou o tipo de célula no qual são expressos. Para rever a estrutura de um gene eucarioto, consulte a aula 4, item 1.

A perda de função de uma proteína pode ser produzida por mutações nos exons ou em regiões controladoras da expressão. Estas mutações podem ser pontuais (uma base) ou serem constituídas por deleções, inserções, inversões e outros processos.

A gravidade da doença está, em geral, relacionada com a quantidade de função retida. Muitas vezes uma pequena parcela da função original é suficiente para produzir um fenótipo discreto, quando comparado à doença causada pela perda total da função. A fenilcetonúria (PKU), por exemplo, é o mais grave dos distúrbios coletivamente chamados hiperfenilanlaninemia.

Mais não significa necessariamente melhor, e há muitas doenças associadas isto. Há dus forma de aumentar a função da proteína: diretamente aumentar sua concentração, pelo aumento do nível de expressão, ou aumentar a habilidade de cada molécula em desempenhar sua função (ou parte das suas várias funções), ou ainda conferir à molécula habilidade novas.

Geralmente são devidas ao aumento da dosagem gênica (uma cópia extra de cromossomo, duplicações de segmentos gênicos, descontrole do sistema de regulação da expressão, etc.)

Nestes casos muitas vezes a proteína ganha uma função adicional, além dsque ela continua a cumprir. São muito raras, porque normalmente uma mutação reduz ou elimina uma ou mais funções da proteína (nem por isso as mutações têm um sentido evolutivo ou lógico, na Natureza...).

e) Mutações associadas à expressão ectópica (fora do lugar) ou heterocrônica (fora do tempo).

Daqui para diante vamos ver alguns exemplos de como alterações gênicas produzem uma doença genética. Vamos nos ater aos exemplos mais claros na literatura, deixando de lado o aspecto mais geral e as listagens de doenças associadas a um ou outro mecanismo específico. O leitor deverá necessariamente, pelo menos nesta fae de redação deste capítulo, recorrer à literatura de apoio (Thompson e Thompson, Capítulo 12).

A identificação da classe da proteína responsável por um determinado distúrbio é importante para compreensão da fisiopatogenia. A seguir mostramos algumas destas classes e as doenças associadas.

As proteínas diretamente envolvidas num distúrbio genético molecular podem ser proteínas de manutenção (housekeeping), que estão presentes em virtualmente todas as células de um organismo, ou proteínas especiais, ou específicas, que só são produzidas em determinado tecido, ou em determinada fase do desenvolvimento do organismo, ou ambos. A distinção, entretanto, não é absoluta, pois as proteínas de manutenção podem ter níveis muito distintos entre diferentes células ou em diferentes momentos. Entre os 10.000 genes expressos numa célula eucariota a qualquer instante, 90% são genes de manutenção e o restante codifica proteínas especiais.

Em geral podemos admitir que alterações em proteínas específicas devem produzir uma patologia associada apenas ao tecido afetado, mas isto nem sempre é verdade. Por outro lado, embora as proteínas de manutenção seja ubíquas, as patologias associadas a suas alterações frequentemente estão ligadas a determinado órgão ou tecido, em geral onde a proteína e muito abundante. Por outro lado, devemos nos lembrar que mutações nesta classe de proteínas são tão graves que podem inviabilizar o organismo: apenas aquelas com expressão clínica menor levam a nascimentos vivos.

É comum observar nesta classe de distúrbios genéticos uma diferença significativa da gravidade da doença entre diferentes pacientes. Há três causas para isto.

a) A mais comum é a heterogeneidade alélica, isto é, a presença de vários alelos para aquela proteína. dependendo da quantidade total de proteína funcional que o indivíduo produz, ele será mais ou menos afetados. Alternativamente, o produto de um dos alelos pode ter uma sub-função específica. Nestes casos, certos alelos são ligados a determinados aspectos clínicos (é o caso dos vários alelos mutantes da b-globina; mutações deste tipo provocam cianose e outros problemas menores, sinais tão distintos das formas graves da doença -talassemias, provocadas pela perda total de função do gene, que é impossível associar clinicamente as duas anomalias como provenientes de mutações do mesmo gene).

b) heterogeneidade de locus é outra causa de variação clínica, e ocorre quando dois ou mais genes distintos podem levar à mesma doença. É o caso, por exemplo, da hiperfenilalaninemia, na qual mutações em qualquer um dos 5 genes da via pode levar à doença, mas com níveis de comprometimento muito distintos.

c) há ainda genes modificadores e fatores ambientais, que podem modular para mais ou menos o quadro clínico associado a uma determinada patologia genética. Um caso curioso é a melhora observada nos pacientes com b-talassemia, que também herdam um alelo mutante para a-talassemia.

Em seguida vamos rever (ou indicar) alguns distúrbios representativos de cada uma das funções descritas na tabela acima.

As doenças genéticas causadas por alterações de enzimas são chamadas enzimopatias. Vamos aqui rever brevemente algumas delas, separando pelo grupo de moléculas diretamente ligadas à ação das enzimas.

O exemplo clássico é a PKU, ou fenilcetonúria. Nesta doença, que afeta 1 em cada 10.000 crianças, o nível sérico de fenilalanina é muito aumentado por mutações de perda de função da fenilalanina hidroxilase (PAH), cujo gene está no cromossomo 12, ou nos genes para a síntese ou reutilização do co-fator (BH4). A enzima PAH transforma fenilalanina em tirosina. A fenilalanina é um importante aminoácido presente na dieta humana, Se estiver presente na dieta do paciente com PKU, o acúmulo de fenilalanima nos tecidos corpóreos prejudica o desenvolvimento do sistema nervoso central no lactente e interfere com o funcionamento do cérebro maduro. A forma grave tem efeitos devastadores sobre o desenvolvimento do paciente.

A enorme quantidade de fenilalanina nos líquidos corpóreos permite que uma pequena fração seja metabolizda por vias alternativas, dando o ácido fenilpirúvico, um cetoácido, que é excretado na urina (daí o nome da doença). Embora o mecanismo molecular da doença seja conhecido há muitos anos (a ligação da fenilalanina com o retardo mental é de 1934), a patogenia do retardo mental é desconhecida. A doença é evitada pelo diagnóstico precoce (teste do pezinho) e pela adoção de dieta restritiva em fenilalanina. Na mesma via metabólica em que a fenilalanina toma parte, as mutações que suprimem a ações de várias outras enzimas também provocam doença, como mostrado na figura abaixo. Mais uma vez fica claro que a relação entre o defeito metabólico e o quadro clínico da doença em geral é obscura e numa mesma via o bloqueio de diferentes etapas produz quadros muito diversos.

Vários outros distúrbios, com diferentes graus de morbidade, estão associados à perda ou redução da função enzimática na via da fenilalanina, como mostrado na figura abaixo. Da mesma forma que mostrado para esta via, a perda de função de uma determinada enzima de uma via pode causar um distúrbio clinicamente muito distinto de outro, ocasionado pela enzima seguinte ou anterior na mesma via.

Figura 2: Uma pequena parte do mapa metabólico humano, mostrando as consequências das falhas em várias enzimas específicas. Os fenótipos das doenças estão mostrados nas caixas azuis (Baseado em I. M. Lerner e W. J. Libby, Heredity, Evolution, and Society, 2a. ed. © 1976 W. H. Freeman & Co.)

A doença de Tay Sachs, um distúrbio metabólico hereditário associado frequentemente a populações de judeus Ashkenazi, também tem uma incidência mais elevada entre canadenses de origem francesa, Cajuns do sudoeste do estado de Louisiana (EUA) e outras populações espalhadas no globo. A severidade da doença e o seu início são variáveis: a doença pode ser infantil ou juvenil e se manifesta com paralisia, demência, cegueira e morte prematura (em geral entre 2 e 4 anos, na forma infantil), mas pode também se manifestar apenas na fase adulta, com disfunção de neurônios e psicose. Entre crianças Ashkenazi a doença é 100 vezes mais frequente que na população geral.

A doença é recessiva e causada por mutações em ambos os alelos do gene HEXA, no cromossomo 15. O gene codifica a sub-unidade alfa da enzima b-hexosaminidase A. Esta enzima lisossomal quebra um lipídio chamado gangliosídeo G_M2. Na doença de Tay Sachs a enzima é inexistente ou encontrada apenas quantidades muito reduzidas, o que leva a um rápido acúmulo do gangliosídeo no neurônio. A neurodegeneração progressiva observada nas várias formas da doença é dependente do velocidade e intensidade de acúmulo do G_M2. que, por sua vez, é dependente da atividade residual de HEXA no organismo.

Figura 3: Modelo para o metabolismo do gangliosídeo G_M2. Em condições normais o G_M2 , um componente da membrana de neurônios, quando desnecessário, é quebrado no lisossomo pela b-hexosaminidase. Para isto são necessários 3 componentes: uma sub-unidade a, uma sub-unidade b e uma sub-unidade ativadora. Na doença de Tay Sachs é a sub-unidade a que está inativa ou funciona mal. o que leva a um acúmulo tóxico de G_M2. (adaptado de Chavany,C e Jendoubi, M (1988) Mol. Med. Today 4:158-165)

A maioria das mutações (alelos mutantes do gene selvagem) leva a perdas graves da função da HEXA. A mutação mais frequente, tanto nas populações em geral como entre os judeus Ashkenazi, é a inserção de 4 bases dentro de um códon para serina na sequência do gene, que leva ao aparecimento, 4 códons em seguida, de um sinal de terminação da tradução (stop códon) precoce. Esta é uma mutação de quadro de leitura ou frameshift.

Esta classe de doenças decorrentes de defeitos de moléculas receptoras começou a ser elucidada em 1974 por Goldstein e Brown, através do estudo do receptor para a LDL (lipoproteína de baixa densidade) como princiapl elemento para a determinação do distúrbio conhecido como hipercolesterolemia familiar. O estudo detalhado da doença contribuiu muito para o conhecimento do metabolismo de lipídeos no ser humano.

A doença se caracteriza pelo aumento do colesterol plasmático, levado pela LDL, a principal proteína de transporte de colesterol no plasma. A figur abaixo mostra esquematicamente a partícula de LDL.

Figura 4: Estrutura da LDL. Cada partícula de LDL contém aproximadamente 1500 moléculas de colesteril-éster num núcleo oleoso. O núcleo é envolvido por uma capa contendo 500 moléculas de colesterol, 800 moléculas de fosfolipídeo e uma molécula de apolipoproteína B100.

Daqui para diante está muito confuso, mas deixo como orientação de leitura. Vou tentar fazer algo coerente pelo menos para antes do provão. Todos devem:

Aprofundar (essencialmente os aspectos genéticos, com ênfase menos aos aspectos bioquímicos):

grupo 1: PKU e Doença de Tay-Sachs (hexosaminidase)

grupo 2: hipercolesterolemia familiar

grupo 3: fibrose cística

grupo 4: distrofia muscular de Duchenne

grupo 5: doença de Alzheimer

grupo 6: síndrome do X frágil

The LDL receptor The LDL receptor includes 700 extracellular amino acids, a transmembrane α helix of 22 amino acids, and a cytoplasmic tail of 50 amino acids. The N-terminal 292 amino acids constitute the LDL-binding domain. Six amino acids within the cytoplasmic tail define the internalization signal, first recognized because the mutation of Tyr to Cys in a case of familial hypercholesterolemia prevented concentration of the receptor in coated pits.

The cystic fibrosis (CF) protein acting as a chloride-permeable channel in the outer cell membrane. The site of the three-nucleotide-pair deletion common among mutant CF alleles is shown. © 1999 by W. H. Freeman and Company.

grupo 4: distrofia muscular de Duchenne - linkar com o gene da distrofina na aula 2?

Molecular Medicine: Muscular Dystrophy and the Cytoskeleton

The Disease

The muscular dystrophies are a group of hereditary diseases characterized by the progressive loss of muscle cells. Duchenne's muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe form, affecting approximately one out of every 3500 male children. Children with DMD are usually unaffected until three to five years of age, when muscular weakness is first observed. Progressive loss of muscle then relentlessly continues, usually leaving affected children confined to wheelchairs by age 12 and frequently leading to death as a result of respiratory failure by the late teens or early twenties. Becker's muscular dystrophy (BMD) is a less common form of the disease, with an incidence of one in 30,000 male births. BMD is also less severe than DMD, and many BMD patients are able to live normal lives with minimal restrictions.

Molecular and Cellular Basis

The much higher incidence of DMD and BMD in boys than in girls initially suggested that both diseases result from recessive sex-linked genes. This hypothesis was confirmed by genetic studies, which localized the DMD/ BMD gene to a specific region of the X chromosome. On the basis of its chromosomal position, the gene responsible for DMD and BMD was cloned by the research groups of Lou Kunkel and Ron Worton in 1986. Sequence analysis established that it encodes a 427-kd protein, called dystrophin, which is related to spectrin. Dystrophin is linked to the plasma membrane of muscle cells by a complex of transmembrane proteins. These transmembrane proteins in turn bind to components of the extracellular matrix, so dystrophin plays a key role in anchoring the cytoskeleton of muscle cells to the extracellular matrix. This anchorage is thought to stabilize the plasma membrane and enable the cell to withstand the stress of muscle contraction. The mutations responsible for DMD or BMD result either in the absence of dystrophin or in the expression of an abnormal protein, respectively, consistent with the severity of disease in DMD and BMD patients.

Prevention and Treatment

Identification of the DMD/BMD gene has allowed the development of sensitive diagnostic tests, such as the detection of mutations by the polymerase chain reaction. Women carrying mutant alleles of the DMD/BMD gene can thus be identified, and their pregnancies monitored to determine if the mutant gene has been transmitted to the fetus. Because of the sensitivity of PCR analysis, mutations can also be detected in early embryos derived by in vitro fertilization procedures prior to their return to the uterus. The combination of genetic counseling and prenatal diagnosis thus has the potential of preventing the transmission of inherited DMD/ BMD cases.

Unfortunately, the effectiveness of this approach is limited by the fact that approximately one-third of DMD cases are not inherited, but result instead from new mutations. These cases cannot be predicted by genetic analysis, so development of an effective therapy remains a compelling goal. Present efforts are focused on the use of gene therapy to restore dystrophin expression in muscle or to increase the expression of other dystrophin-related proteins that might compensate for its absence. Although treatment of muscular dystrophy remains a goal of future research, understanding its molecular basis has revolutionized diagnosis and permitted rational approaches to the development of new therapies.

Fragile X syndrome is the most common inherited form of mental retardation currently known. Fragile X syndrome is a defect in the X chromosome and its effects are seen more frequently, and with greater severity, in males than females.

In normal individuals, the FMR1 gene is transmitted stably from parent to child. However, in Fragile X individuals, there is a mutation in one end of the gene (the 5' untranslated region), consisting of an amplification of a CGG repeat. Patients with fragile X syndrome have 200 or more copies of the CGG motif. The huge expansion of this repeat means that the FMR1 gene is not expressed, so no FMR1 protein is made. Although the exact function of FMR1 protein in the cell is unclear, it is known that it binds RNA.

A similar nucleotide repeat expansion is seen in other diseases, such as Huntington disease. Research in mice has proven helpful in elucidating some of the mechanisms that cause the instability of this gene. Our methods for identifying carriers of Fragile X syndrome have also improved, and further research will help people carrying "premutations" to avoid having children who have a larger expansion (i.e. more CGG repeats) in FMR1, and therefore suffer from Fragile X syndrome.

Legenda: Human FMR gene is located at Xq27.3 and contains 17 exons encoding FMRP. This loss of function disease is due to expansion of CGG repeat which results in absence or deficit of FMRP by methylation of full mutation. The CGG expansion occurs in the first FMRP exon which would be located within the 5'UTR (untranslated region) of FMRP mRNA.

FMRP is a 71 kDa protein whose 632 amino acids contain both nuclear export (aa430-aa437) and nuclear localizing (aa114-aa150) elements. The only other clues to the possible function of FMRP are multiple RNA binding elements; 2 KH (aa222-aa251, aa285- aa314) and 1 RGG box (aa534-aa548).

Função		Doença (enzima)	Herança
Enzimas	aminoácido	PKU (fenilalanina hidroxilase)	AR
	lipídios complexos	Doença de Tay-Sachs (hexosaminidase)	AR
Transporte e estocagem	entre órgãos	talassemias (hemogloniba)	AR
Estrutura de células e órgãos		osteogênese imperfeita (colágenos tipo I e II)	AR
Expressão gênica desenvolvimental	fatores de transcrição	Tumor de Wils (WT1, um fator de transcrição com zinc finger)	AD
Metabolismo e comunicação celular	Canais célula-célula	Mal-formações cardíacas, defeitos de lateralidade (conexina 26 nas junção tipo gap)	AR
	Receptores hormonais	diabetes insipidus (receptor de vasopressina V2)	XR

A base molecular e bioquímica das doenças genéticas