mendel

Home        Cronograma        Notícias        Animações        Bibliografia

 

 

Mutações e Reparo

Este texto está baseado em dois sites da internet, com uma revisão básica. Esperamos poder oferecer um texto mais completo no 2o. semestre de 2008

MUTAÇÕES

Tópicos

    Conceito

    Origem

    Agentes Mutagênicos

    Aspectos Gerais

    Mutações e o Melhoramento

    Taxa de Mutação




CONCEITO


Mutações gênicas são mudanças repentinas que ocorrem nos genes, ou seja, é o processo pelo qual um gene sofre uma mudança estrutural. As mutações distinguem-se das aberrações por serem alterações a nível de ponto, envolvendo a eliminação ou substituição de um ou poucos nucleotídeos da fita de DNA.

Obs: muitas mutações podem afetar sequências fora das regiões codificantes para a proteína codificada pelo gene. Regiões promotores, sítios de poliadenilação e muitos outros elementos reguladores podem sofrer mutações, que vão eventualmente ter como consequência uma alteração no nível de expressão do gene, no destino da proteína codificada ou na velocidade de turn-over.




ORIGEM



Adição ou subtração de bases

A adição ou subtração de bases altera o código genético (na verdade, altera o quadro de leitura e muda os códons a partir do ponto onde houve a inserção ou retirada de base), definido pela seqüência de três bases adjacentes no mRNA, e consequentemente poderá alterar o tipo de aminoácido incluído na cadeia protéica e, em última analise, poderá alterar a expressão fenotípica.

Se a mutação for fora da região codificante ela pode, ainda assim, alterar o fenótipo, como discutido na observação do item conceito.

Substituição de bases

A substituição de uma purina (adenina e guanina) por outra purina, ou de uma pirimidina (citosina e timina) por outra pirimidina é denominada de transição. A substituição de uma purina por uma pirimidina, ou vice-versa é denominada de transversão.

A substituição de bases dentro da região codificante do gene pode mudar o aminoácido codificado ou ainda criar um códon de parada, resultando numa proteína mais curta e, possivelmente, não funcional. Mesmo quando uma mudança de bases resulta num códon para o mesmo aminoácido original (chamada substituição sinônima), ainda assim o fenótipo pode se alterar, devido à preferência do uso de códons. Um códon de uso infrequente no genoma do organismo terá poucos RNA transportadores disponíveis para ele, o que redundará na redução da taxa de síntese da proteína codificada, o que pode resultar em mudança de fenótipo.

A substituição de bases fora das regiões codificantes pode ter bastante efeito no fenótipo, também, se afetar regiões controladoras, sinais de splicing, etc.




AGENTES MUTAGÊNICOS


Os agentes mutagênicos são de natureza química ou física. A seguir é descrito alguns agentes e suas ações.

Agentes Físicos

a) temperatura

Em determinados organismos a variação de 10ºC pode duplicar a taxa de mutação.

Os organismos estão habituados a multiplicar numa determinada faixa de temperatura. Fora dela as enzimas não funcionam adequadamente, inclusive aquelas responsáveis pelo reparo de DNA. Daí o aumento da taxa de mutação.

b) Radiações

b1) Ionizantes

São os raios X, alfa, beta e gama. Atuam alterando a valência química, através da ejeção (expulsão) de elétrons. A taxa de mutação é geralmente proporcional à dosagem de irradiação (principalmente no caso de raio X). Esta regra se aplica à quantidade de danos mas não à qualidade. Uma única mutação poderá ser de importância vital para o organismo.

No homem, quando a dosagem é inferior à 50 mR (miliroentgens) não se percebe qualquer lesão imediata, embora alguns efeitos nocivos ocultos possam ocorrer como a indução de leucemia e redução do tempo de vida.

Na natureza é incomum a exposição a doses significativas de radiação ionizante. Entretanto, certos tipos de solo podem ser radiativos, como as areias monazíticas, e a exposição à radiação vaira, por isso, de lugar para lugar e dependendo da forma como o organismo interage com a substância radioativa. Certos produtos, como o fumo, podem levar a um acúmulo progressivo de elementos discretamento radioativos no pulmão.

As radiações ionizantes produzem muitos tipos de lesões no DNA, inclusie quebras simples e duplas de cadeia.


b2) Excitantes

São os raios que atuam aumentando o nível de energia do átomo, tornando-os menos estáveis. O exemplo típico é a ultra violeta (curta e longa, embroa a curta tenha mais energia) que provoca dímeros de timina através de ligações covalentes. Os raios ultra violeta não penetram tão bem quanto os raios X, mas são prontamente absorvidos por alguns pontos específicos do indivíduo (essencialmente DNA de células próximas à superfície do corpo).

Agentes Químicos

Existem várias substâncias químicas com efeito mutagênico, entre elas pode-se citar o HNO2, hidroxilamina e a cafeína (muito usado em pesquisa é o metil metano sulfonato - MMS e seu derivado, o etil metano sulfonato - EMS). O ácido nitroso e a hidroxilamina (NH4)OH atuam provocando substituição de bases.
A cafeína, por exemplo, é um derivado da purina; várias purinas foram indicadas como substâncias que causam quebras nos cromossomos de plantas e bactérias. Por este motivo, sempre houve grande interesse pela cafeína por causa da grande quantidade que o homem civilizado ingere através do chá ou café.
Em experimentos com ratos não foi encontrado nenhuma quebra de cromossomos quando estes foram tratados com doses máximas toleráveis. Quando células humanas, em cultura de tecido, foram expostas a solução de cafeína, foram encontradas algumas quebras cromossômicas. Foi relatado que havia evidências de que a cafeína tem um efeito mutagênico fraco.
Em bactérias descobriu-se que a adenosina, constituinte do ATP, anulava a ação da cafeína e de outros derivados de purinas. Ela também reduz a quantidade de mutações espontâneas.

Agentes mutagênicos e anti-mutagênicos estão listados às centenas na literatura. Sua ação depende muito da dose.




ASPECTOS GERAIS


Origem de novos alelos

A mutação proporciona o aparecimento de novas formas de um gene e, consequentemente, é responsável pela variabilidade gênica. Entretanto, o processo de melhoramento, via mutação induzida, não é muito usado por ser caro, trabalhoso e de resultado incerto. Em caso de necessidade, é mais fácil fazer uso da variabilidade genotípica obtida pelos processos meióticos, do que tentar gerar variabilidade gênica.

Podem ser reversíveis

As mutações podem se reverter, mas a mutação nos dois sentidos não ocorre com a mesma taxa. A reversão requer uma mudança especifica, mas a mudança original pode ocorrer em qualquer um dos nucleotídeos da estrutura do gene. Em mutações espontâneas tem sido verificado que u (taxa de mutação) é aproximadamente 10 vezes superior a v (taxa de retromutação).

Mutações espontâneas vs induzidas

As mutações serão ditas espontâneas quando as causas que deram origem à alteração no DNA são desconhecidas. Quando se conhece a causa diz-se que a mutação foi induzida. Em geral, as mutações espontâneas ocorrem em proporção de 1/10^6 a 1/10^5 (depende fortemente do organismo). Através da indução pode-se aumentar a freqüência da mutação, mas, de maneira geral, não se pode orientá-la, no sentido desejado.

A estratégia dos vírus, por exemplo, é obter variabilidade a partir de uma taxa de mutação elevada. De uma forma geral, quando mais rápida é a multiplicação do organismo e quanto maior a progênie, maior a taxa de mutação.
Um exemplo de uma mutação espontânea vantajosa é o cultivar de soja "Viçoja" mutante originado de plantações de soja. Nestas plantações surgiu uma planta mais alta, tardia e que não segregou dando origem, posteriormente, ao cultivar "UFV - 1".  Esta é a forma pela qual as plantas e animais têm sido "melhorados" pela humanidade: na prole observa-se os que têm algum fenótipo de interesse e, a partir dele, procura-se continuar a criação/ plantação, incorporando esta "marca".

Podem ser recorrentes

Como as mutações se repetem tanto no tempo como no espaço, podemos associá-las a determinadas taxas, e deduzirmos teoricamente o seu efeito como agente de alterações da freqüência gênica de uma população.

É curioso observar que as mutações não ocorrem em taxas iguais ao longo do genoma: há hotspots para mutação, com taxas muito superiores à media do genoma e, ao contrário, regiões onde a frequência é mais baixa. Não há uma explicação clara para isso.

Podem ser hereditárias

A mutação será hereditária quando atingir uma estrutura gamética ou qualquer órgão que venha contribuir para a formação da geração descendente. Uma mutação somática poderá ser transmitida de geração após geração, quando a espécie em consideração contar com algum processo que permita a multiplicação da mutação na área somática. Este fato é frequente quando a espécie contar com qualquer processo de propagação vegetativa, como as plantas.





MUTAÇÕES E O MELHORAMENTO


O processo evolutivo consiste basicamente em concentrar em uma população indivíduos com maior freqüência de genes favoráveis. Um organismo evoluído é resultante de um processo de seleção, no qual as mutações que lhe eram vantajosas foram preservadas. Portanto, para estes indivíduos é pouco provável que alterações aleatórias nos genes possam contribuir para melhorias, uma vez que o organismo já se encontra em estágio avançado de seleção. Assim, de maneira geral, considera-se que a maioria das mutações são prejudiciais.

A mutação é responsável pela variabilidade gênica e por extensão pela variabilidade genotípica. Ela fornece a matéria prima para o processo evolutivo e, em algumas situações é fundamental para o melhoramento, cujo sucesso depende da existência de variabilidade. Entretanto, os organismos mais evoluídos apresentam uma grande diversidade de germoplasma (conjunto de DNA), que associada ao processo meiótico, tem fornecido materiais adequados às exigências dos programas de melhoramento.

O uso de agentes mutagênicos é caro, trabalhoso e de resultado incerto. Seu uso tem se justificado quando não mais existe variabilidade no germoplasma.

A engenharia genética, a mais recente aliada do melhoramento genético, pode introduzir genes de outros organismos em plantas, animais, leveduras, etc. Este processo não depende da diversidade do germoplasma da espécie a ser melhorada e o novo gene geralmente pode ser inserido e expresso, embora ainda não hajam mecanismos que permitam um posicionamento do inserto numa região desejada. A inserção se fz em um lugar aleatório que é, depois, determinado por técnicas usuais de biologia molecular.



TAXA DE MUTAÇÃO


O cálculo da taxa de mutação pode ser realizado para os diversos caracteres, avaliando-se cruzamentos específicos. Como ilustração será considerado o estudo da taxa de mutação do alelo a para A, que controla a cor da flor em uma espécie vegetal. Nesta espécie a condição A_ determina as flores vermelhas e aa as flores brancas.

Cruzamento entre plantas de flores brancas, considerando a ocorrência de mutação de a para A igual a u, produzem descendentes com a seguinte freqüência genotípica e fenotípica:

Brancas (aa) x Brancas (aa)

Gametas
A(u)
a(1-u)
A(u)
AA u²
Aa u(1-u)
a(1-u)
Aa u(1-u)
aa (1-u)²



Desta forma espera-se encontrar a seguinte relação fenotípica:

Fenótipos
Freqüência
Vermelhas
u²+2u(1-u)
Brancas
(1-u)²



Como ilustração será considerado um experimento em que foi avaliada a descendência do cruzamento entre plantas de flores brancas. Foram observadas 498 plantas de flores brancas e duas vermelhas. Admitindo que as plantas de flores vermelhas são mutantes, pode-se considerar que:

f(Observado de plantas de flores brancas) = 498/500

f(Esperada de plantas de flores brancas) = (1 - u)²

Considera-se que:

(1-u)² = 498/500

Obtém-se:

u = 1/500

 

REPARO DE DNA: mecanismos, doenças associadas, envelhecimento e câncer

fonte daqui ao final do texto: http://www.icb.ufmg.br/prodabi/grupo2/grupo2.html  

INTRODUÇÃO

    Embora a mutação seja uma das principais fontes para a evolução, a estabilidade do material genético também é fundamental para a continuação da vida. O DNA está exposto a uma série de agentes físicos, como luz ultravioleta (UV), e químicos que provocam lesões nessa molécula. Caso não sejam removidas, essas lesões podem levar a mutações ou à morte celular.
Os organismos desenvolveram uma série de mecanismos capazes de remover lesões e, com isso, manter uma maior estabilidade do material genético. Existem mecanismos que fazem a reversão da lesão, como é o caso da enzima fotoliase que desfaz dímeros de pirimidina na presença de luz. Outros mecanismos removem a lesão, independentemente da luz.
    O estudo do reparo de DNA no homem sempre esteve muito associado a doenças humanas. Um dos primeiros avanços nesta área de pesquisa foi feita por James Cleaver em 1968, quando ele demonstrou que as células de pacientes com a síndrome do xeroderma pigmentosum (XP) são deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos.

 

PRINCIPAIS VIAS DE REPARO DE DNA

Cinco tipos de reparo de DNA são conhecidos:
 

1.Mismatch repair

2. Reparo por excisão de bases (BER)

3. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

4. Reparo direto

5. Reparo por recombinação 

 

1. Mismatch repair

Este sistema repara os maus pareamentos das bases do DNA gerados por erros de replicação.

Em E. coli, o mismatch repair é direcionado por metilação de sequências GATC na fita que é sintetizada após a replicação. Além da DNA polimerase, SSB (single strand binding protein), helicase, exonuclease e DNA ligase três enzimas especializadas - mut S, mut L e mut H - são requeridas. O mut S se liga nas bases mal pareadas.O mut H se liga na sequência GATC. Se somente uma das fitas é metilada no GATC,  a proteína mut H  atua como endonuclease sítio-específica clivando a fita não metilada na porção 5' do G no GATCmarcando a fita para ser reparada. A proteína mut L se liga ao mut S e mut H do complexo. Uma vez  que a clivagem ocorreu, a fita de DNA não metilada é degradada do sítio de clivagem até a região de mal pareamento e replicada com DNA novo. Esta fase final utiliza o restante das enzimas listadas acima. Um sistema muito similar de reparo de bases mal pareadas existe nos eucariotos incluindo o homem

A Figura.1 abaixo mostra, na coluna da esquerda, a forma como o DNA é duplicado e a metilação é feita nas fitas novas, alguns minutos após sua formação. Na coluna da direita está mostrada a forma como uma base mal pareada é identificada e retirada. Observe que o sítio de metilação mostrado é um palíndromo, isto é, a sequência é igual nas duas fitas, semelhantemente a um sitio de restrição. Para a excisão, três proteínas Mut colaboram para torcer o DNAe clivar a fita nova (nick) próximo ao sítio com a lesão (no caso, um G). Uma exonuclease retira várias bases abaixo do sítio lesado. A DNA polIII ressintetiza o espaço deixado e a ligase (não mostrada) sela a fita.

2. Reparo por excisão de bases (BER)

Este processo é conduzido pelas enzimas  DNA glicosilases que reconhecem os produtos de citosina e adenina deaminadas (um tipo de lesão frequente) no DNA gerando uracila e hipotanina.

Esse tipo de reparo tem início com a ação de DNA glicosilases que reconhecem e removem bases lesadas da cadeia do DNA pela quebra da ligação N-glicosil, a qual mantém a base nitrogenada associada com o esqueleto de açúcar-fosfato (Friedberg et al., 1995).

As enzimas com atividade de DNA glicosilase foram inicialmente estudadas e caracterizadas em E. coli, mas atualmente diferentes DNA glicosilases foram caracterizadas em eucariotos e essas apresentam grande homologia com as enzimas procariotas. A maioria das DNA glicosilases reconhecem lesões específicas como a adenina metilada na posição 3 (Steinum & Seeberg, 1986) ou a 8-hidroxiguanina (Boiteux et al., 1987).


Após a retirada da base lesada gera-se no DNA um sítio apurínico ou apirimidínico (AP) que será reparado por AP endonucleases (Doetsch & Cunningham, 1990). Os sítios AP também podem ser gerados por hidrólise natural do DNA (Este é um outro dano que este mecanimso repara, que pode ser gerado de forma espontânea ou pode ser induzido(.

Todas as AP endonucleases conhecidas até o momento realizam a quebra do esqueleto açúcar-fosfato na região 5’ deste. O resultado dessa quebra gera duas terminações: uma 3’-OH e outra 5’-fosfato-desoxirribose.  A E. coli apresenta duas AP endonucleases: exonuclease III (xth) e endonuclease IV (nfo). A exonuclease III fo   i inicialmente caracterizada como uma exonuclease com uma atividade associada de fosfatase (Doetsch & Cunningham, 1990). Atualmente, sabe-se que a principal função fisiológica dessa proteína é a atividade de 5’ AP endonuclease. Essa enzima  tem aproximadamente 28 kDa e é capaz de atuar eficientemente tanto em sítios apurínicos quanto  apirimidínicos (Gossard & Verly, 1978).  Por sua vez, a endonuclease IV de E. coli não é detectada em extrato bruto de células selvagens, uma vez que ela é responsável por somente 10% da atividade de AP endonuclease em extratos brutos (Ljungquist, 1977). Essa enzima apresenta atividade AP endonuclease semelhante à exonuclease III.


Após a ação das AP endonucleases é necessário que ocorra a remoção de resíduos 5’-fosfato-desoxirribose. Essa etapa é realizada pela enzima DNA desoxirribo-fosfodiesterase (dRpase), para que uma DNA polimerase possa reconhecer e complementar a lacuna gerada pela retirada do nucleotídeo (Friedberg et al., 1995).

A similaridade e conservação entre os genes de eucariotos e procariotos é também funcional, já que genes de eucariotos são capazes de complementar  bactérias deficientes em genes envolvidos no reparo por excisão de base (Friedberg et al., 1995). A possibilidade dessa complementação ocorrer advém do fato das enzimas que atuam nesse tipo de reparo reconhecerem lesões específicas e não precisarem montar um complexo enzimático para a retirada da base lesada.

A Figura 2 esquematiza os vários passos deste reparo. Observe que aqui não é preciso que se sinalize qual a fita nova, já que há uma lesão e não apenas um erro no pareamento de bases.

AJUSTADO ATÉ AQUI (06-06-2008)

3. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
 
        Este sistema, que têm sido estudado com maior ênfase em bactérias, repara vários tipos de lesões, incluindo dímeros de ciclobutil pirimidina e dímeros 6-4 de piridimidina induzidos pela radiação ultravioleta (luz UV). As enzimas-chave formam um complexo chamado endonuclease de excisão ABC ( produto dos genes uvrA, uvrB e uvrC na Escherichia coli). Ao se ligar ao DNA no sítio da lesão causada pelo agente mutagênico o complexo ABC cliva a fita contendo a lesão duas vezes, antes e depois da lesão, na mesma. Aqui também não é preciso saber qual é a fita nova, nem faz sentido, porque a replicação pode ter ocorrido muito tempo antes: a lesão é que determina que fita vai ser clivada. A lesão é removida do DNA como parte de um resíduo de 12 a 13 oligonucleotídeos. Os detalhes da reação são os seguintes: UvrA é a enzima de reconhecimento da lesão. Ela forma um complexo A2B1 com UvrB, se liga no sítio da lesão, desenrola o DNA causando uma modificação conformacional em uvrB que facilita a sua adesão no sítio da lesão. UvrA se dissocia do complexo UvrB-DNA, que forma um sítio específico para a ligação da enzima uvrC. Com a ligação de uvrC, uvrB faz uma incisão 3' abaixo da lesão, que causa uma mudança conformacional no complexo, facilitando UvrC a fazer uma incisão 5' acima da lesão. A remoção da lesão requer a ação da helicase, no caso a  Helicase II (uvrD), que retira o oligômero excisado e de UvrC e o "gap" que resulta disto é reparado pela ação de uma polimerase (DNA polimerase I) que por sua vez desloca a enxima UvrB, selando-se a cadeia de fosfato com  a DNA ligase.  Esta discrição corresponde à Figura 3 abaixo, que não mostra, contudo, a chegada e a saída de cada uma destas enzimas...

Este reparo ocorre em humanos e as vias são bem similares às de E.coli.

http://www.icb.ufmg.br/prodabi/grupo2/reparo/IRL4_DNA_repair_3.gif

 

4. Reparo direto

Dímeros de ciclobutano pirimidina podem ser reparados diretamente sem a excisão por uma enzima chamada DNA fotoliase, que usa a energia derivada da luz absorvida por ela para regenerar as duas pirimidinas que formam dimerizadas pela luz UV. A fotoliase contém dois co-fatores que servem como agentes de absorção de luz (cromóforos), um derivado do ácido fólico.  A Figura  4 abaixo não mostra a ação da enzima, mas sim a forma dos dois produtos da irradiação de pirimidinas com UV, o dímero de timina, à esquerda, e o fotoproduto 6-4. Ambos são desfeitos pela ação da fotoliase, quando iluminada com luz visível.]]

http://www.icb.ufmg.br/prodabi/grupo2/reparo/IRL4_DNA_repair_4.gif

Um outro exemplo de reparo direto envolve o reparo de O8metilguanina no DNA formada pela ação de certos agentes alquilantes. O8metilguanina é uma lesão altamente mutagênica e carcinogênica. A enzima O8metilguanina DNA metil transferase remove este grupamento metil da guanina transferindo este para um resíduo específico de citosina na transferase, inativando-a.  

A Figura 5 é muito ruim, mas com a devida explicação torna-se um auxílio à compreensão do ponto. Na parte esquerda ao alto está o par GC normal. Logo abaixo dele aparece o par 08-metilguanina - timina. De onde ele surgiu? A 08-metilguanina é o produto de alquilação da guanina, mencionado no texto acima: observe que há mais um carbono  na parte ao alto, à direita, da molécula. E a timina? Ela aparece após a replicação, quando a DNA polimerase "interpreta a 08-metilguanina como se fosse uma adenina (daí só serem mostradas duas pontes de hidrogênio no par). Isso está representado na parte direita da figura, iniciando com a metilação (na horizontal) e seguindo para duas replicações sucessivas, representadas na vertical. O mecanismo em si da reversão (reparo) da lesão está mostrado abaixo, na esquerda da figura: observe que o resíduo metil, que estava na 08-metilcitosina, vai parar na própria enzima, que desta forma fica inativa.

http://www.icb.ufmg.br/prodabi/grupo2/reparo/IRL4_DNA_repair_5.gif


5.Reparo por recombinação

        Se durante a replicação cromossomal, uma forquilha de replicação encontra uma lesão (por exemplo um dímero de timina) antes da ação do reparo por excisão ou da ação do sistema de fotoliase (ou depois que tudo foi tentado e a lesão permaneceu...), a DNA polimerase irá parar a replicação no dímero encontrado (e retomar o processo vários pares de base adiante, a partir do lugar onde for inserido outro primer de RNA).Esta região será então reparada por recombinação entre dois dúplexes de DNA na forca de replicação.

A figura 6 abaixo mostra este reparo. A lesão na fita de cima da forquilha impede que sua fita complementar seja sintetizada pela DNA pol neste trecho. Por recombinação, um trecho complementar na fita velha é removido e colado à fita complementar recém sintetizada, fechando o espaço. O novo espaço deixado na fita velha é fechado pela DNA pol e a cadeia de fosfato selada com a ligase. Após este processo, 25% dos indivíduos (aqueles resultantes da fita simples com lesão) serão utantes e os outros 75% normais. Se o reparo não tivesse acontecido, os mutantes seria 50%.

A imagem “http://www.icb.ufmg.br/prodabi/grupo2/reparo/IRL4_DNA_repair_6.GIF” contém erros e não pode ser exibida. 



REPARO DE DNA EM ORGANELAS

 

          Desde a descoberta de que a mitocôndria apresenta um genoma próprio, independente do genoma nuclear, levantou-se a questão se ele estava sujeito aos mesmos mecanismos de reparo que ocorrem no genoma nuclear. Por muito tempo acreditou-se que o reparo de DNA não estava presente no genoma dessa organela: o reparo não seria necessário devido à redundância da informação genética presente nas várias cópias do DNA das organelas (na verdade, nas várias mitocôndrias - e também cloroplastos - em geral presentes numa única célula). Essa visão era reforçada pelas observações de que: o genoma dessa organela não codifica para nenhum gene envolvido no reparo do DNA (Britt, 1996); o DNAmt apresenta uma maior taxa de mutação quando comparado com o nuclear (Richter et al., 1988); e pelo fato de que algumas lesões, como dímeros de pirimidina, não são removidas eficientemente do DNA mitocondrial (DNAmt) de mamíferos (LeDoux et al., 1992).

 
         No entanto, a retirada eficiente de purinas metiladas  (LeDoux et al., 1992); a presença da enzima UV endonuclease na mitocôndria de mamíferos (Tomkinson et al., 1990); além dos estudos de Thyagarajan e colaboradores. (1996), que verificaram que extratos protéicos mitocondriais são capazes de catalisar a recombinação de plasmídeos "in vitro" (sendo que os autores sugerem que esta atividade de recombinação está relacionada com o reparo de DNA mitocondrial); indicam que o genoma de organelas está sujeito a outros tipos de reparo, embora nenhuma evidência sugira que ocorra o reparo por excisão de nucleotídeos nesta organela.
        
        Os dados mais interessantes sobre o reparo de DNA mitocondrial advêm do estudo com plantas e levedura. Pang e colaboradores (1993) clonaram um gene de Arabidopsis thaliana capaz de complementar bactérias deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos. O gene ainda não tem função definida e não apresenta homologia com nenhum gene conhecido, entretanto, verificou-se que seu produto é direcionado para cloroplasto e mitocôndria. Outro gene de planta, thi1, também é capaz de complementar bactérias deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos (Machado et al., 1996). Esse gene, além de participar na síntese de tiamina, também esta envolvido na estabilidade do DNA mitocondrial, tanto em planta, como em S. cerevisiae (Machado et al., 1997).

        
         O conhecimento do reparo de DNA mitocondrial pode ser essencial no estudo de diversas doenças que estão associadas com a mitocôndria, bem como com o processo de envelhecimento.




DOENÇAS HUMANAS RELACIONADAS AO REPARO DE DNA

        Dentre diversas outras doenças humanas relacionadas com deficiências no reparo do DNA, podemos citar a síndrome de Cockayne's (CS) e a tricotiodistrofia (TTD) e o XP (Xeroderma Pigmentosum). Nos três casos o paciente apresenta alguma deficiência no reparo por excisão de nucleotídeos e transcrição do DNA (Friedberg, 1996). Os estudos com células de pacientes XP permitiram a clonagem dos genes humanos envolvidos no reparo por excisão de nucleotídeos.
     O mecanismo do reparo por excisão de nucleotídeos no homem é muito semelhante ao descrito para E. coli. Neste organismo, o gene XPA é responsável pelo reconhecimento da lesão e recrutamento dos outros componentes desse sistema de reparo (Sancar, 1996). Os genes XPB e XPD estão envolvidos na estabilização do complexo de pre-incisão. Entretanto, o achado mais importante verificado para esses genes é que as proteínas por eles codificados fazem parte do fator de transcrição IIH (TFIIH)(Sancar, 1996). Esse fato está de acordo com a descoberta de Bohr e colaboradores (1985) da existência do reparo de DNA preferencial de genes transcritos. (Faz sentido: como o genoma é muito grande, mas apenas 2,5% são transcritos - representando o que chamamos de genes - é importante que o reparo seja feito preferencialmente nestas regiões, deixando que lesões nas demais áreas se acumulem gradualmene ou seja reparadas apenas numa segunda instância)
     Os genes XPG e XPF são os responsáveis pela incisão do DNA contendo o nucleotídeo lesado (Sancar, 1996). Diferentemente do verificado em E. coli, no homem, o fragmento excisado é de 23 nucleotídeos e não de 12. Mutações nos genes CSA e CSB são responsáveis pela CS (Sancar, 1996). Esses genes parecem estar envolvidos com o reparo preferencial de genes transcritos, pois existem evidências de que o heterodímero formado pelas proteínas CSA e CSB reconheceriam a RNA polimerase II, bloqueada em uma região de DNA lesado e seriam, então, responsáveis pelo recrutamento do complexo de reparo por excisão de nucleotídeos (Sancar, 1996).
     A TTD, além de apresentar um fenótipo relacionado a deficiência no reparo de DNA, também apresenta como característica uma menor ocorrência de proteínas ricas em cisteína (Friedberg, 1996). Até o momento, foram identificados três grupos de complementação relacionados com essa doença. Os genes XPB e XPD complementam dois destes grupos, portanto, mutações nesses genes podem levar a duas doenças relacionadas mas com sintomas diferentes (Friedberg, 1996). O gene relacionado ao terceiro grupo de complementação foi denominado TTD-A e sua função ainda é desconhecida.

Os dois artigos mais recentes sobre este assunto podem ser visualizados: o primeiro (620 kB)discute a participação real desta sub-unidade do fator de transcrição e reparo TFIIH no reparo por excisão de nucleotídeo (NER). OTFIIH) é essencial para que a RNA polimerase II possa agir e para o NER. O TFIIH consiste of dez polipeptídeois, incluindo a recém identificada proteína TTDA)/ hTFB5, de apenas 8 kDa. O segundo artigo (1,2 MB) discute e estrutura desta proteína, a formação de dimeros e sua ligação com as demais moléculas, e como certas mutações pontuais afetam sua possível função.

   
     No homem, o reparo por excisão de base é extremamente similar ao verificado em bactérias, tanto que a maioria dos genes humanos, envolvidos nesse mecanismo de reparo, apresentam alta homologia com os genes de E. coli e são capazes de complementar as bactérias deficientes nesses genes (Friedberg, 1995). Até o momento, nenhuma doença humana foi relacionada a esse tipo de reparo, nem mesmo algum tipo de câncer (doença frequentemente associada a deficiência no reparo de DNA) (Lindahl et al., 1997).
     A inviabilidade de camundongos transgênicos nocauteados em genes envolvidos no reparo por excisão de base, além de mostrar a importância desses genes no desenvolvimento embrionário, também pode explicar a ausência de doenças associadas a este tipo de reparo (Lindahl et al., 1997). Obs: A mutação seria letal.
     Apesar de vários genes humanos envolvidos no reparo de DNA já serem conhecidos, novos genes que participam desse processo continuam a ser descritos. Entretanto, até o momento, nenhum gene humano que atua no reparo do genoma mitocondrial foi clonado. (Isso já mudou: está provado que ao menos o BER e o reparo direto existem na mitocôndria, inclusive na humana, e vários genes foram clonados. Para uma revisão sobre o papel da mitocôndria nas doenças, no envelhecimento e sobre o reparo de DNA nesta organela, leiam o artigo muito recente de De Souza Pinto e colaboradores (2008), disponível aqui (500 kB)).
 

Câncer e Envelhecimento

        Lesões causadas no DNA e outras macromoléculas induzidas por espécies de oxigênio reativas têm atraído considerável interesse nos anos rescentes e gerado extensiva discussão na relevância dos danos espontâneos causados no DNA relacionados ao envelhecimento e câncer.
        O xeroderma pigmentoso, uma rara doença de pele nos seres humanos, é geneticamente transmitido como um caráter genético e o paciente possui susceptibilidade à luz ultravioleta (UV). Nestes pacientes, cânceres de pele se desenvolvem em vários locais. Muitos morrem antes de completar 30 anos por metátases destes tumores malignos na pele.
        Os estudos de fibroblastos de pacientes com esta doença revelaram um defeito bioquímico em forma de doença. Nos fibroblastos normais, metade dos dímeros de pirimidina produzidos pela radiação UV são excisados em menos de 24 horas. Por outro lado, quase nenhum dímero é excisado neste intervalo de tempo em fibroblastos derivados de pacientes com xeroderma pigmentoso. estes estudos mostram que o xeroderma pigmentoso pode ser produzido por um defeito na exonuclease que hidrolisa o arcabouço do DNA próximo a um  dímero de pirimidina. As drásticas consequências clínicas deste defeito enzimático salientam a importância crítica do reparo de DNA.
        Em 1895, a costureira de Alfred Warthin lhe disse que ela iria morrer jovem por causa de câncer de cólon ou órgãos femininos porque a maioria dos membros de sua família morria destes tipos de câncer. sua premonição foi correta: ela morreu de carcinoma no útero. Warthin estudou a família dela e observou que de fato  os seus membros familiares tinham alta susceptibilidade ao câncer. Estudos subsequentes mostraram que este distúrbio genético, chamado de câncer colorretal sem polipose hereditário (HPPC) não é raro. Uma em cada 200 pessoas é afetada no mundo. O HPPC resulta  de um reparo  defeituoso de mau pareamento do DNA (Mismatch Repair). As mutações em dois genes, chamados de hMSH2 e hMLH1, contribuem para a maioria dos casos desta predisposição ao câncer.O achado marcante é que estes genes são as contrapartes  humanas de Mut S e Mut L de E.coli. Parece provável que as mutações nestes dois genes importantes deste tipo de reparo geram um acúmulo de mutações no genoma celular. Com o tempo, os genes importantes para o controle da proliferação celular tornam-se alterados, resultando no câncer.

Aqui nada há ainda sobre envelhecimento. Numa etapa posterior de revisão desta página procuraremos melhorar isso.



EXERCÍCIOS SOBRE REPARO DE DNA


Marque com um X a alternativa correta:

01- A presença do reparo de DNA nos organismos é importante para:

(a)Gerar mutações na molécula de DNA para aumentar a variabilidade genética;

(b)Facilitar a morte celular programada (apoptose);

(c)Manter a integridade do material genético;

(d)Gerar mutações nas gônadas para variar o material genético na fecundação.
 

02 - O reparo por excisão de bases (BER) é restrito às lesões causadas por:

(a)Luz ultravioleta;

(b)Radiações ionizantes;

(c)Agentes alquilantes;

(d)Radiações gama.

03 - No MISMATCH REPAIR as enzimas principais encontradas em procariotos são:

(a) uvrA, MutS e uvrB;

(b) MutS, MutH e MutL;

(c)Fotoliase, MutH e uvrC;

(d)DNA glicosilase, AP/endonuclease e DRpase.

04 - No reparo por excisão de nucleotídeos (NER), a região que é excisada do DNA possui:

(a) uma única base que foi lesada;

(b) de 12 a 13 oligonucleotídeos;

(c) 20 oligonucleotídeos lesados;

(d) a região lesada não é substituída, somente reparada.

05 - No reparo direto do DNA, o grupamento metil que é retirado da base lesada do DNA é transferido para:

(a) a molécula de RNA que faz parte da enzima DNA metil transferase;

(b) uma citosina da enzima DNA metil transferase;

(c) uma guanina da enzima DNA metil transferase;

(d) Nenhuma das alternativas acima.

06 - O reparo por recombinação, encontrado principalmente em bactérias, é muito importante na:

(a) transcrição do DNA;

(b) tradução do RNA mensageiro;

(c) formação da forca de replicação;

(d) na replicação dos cromossomos.

07 - Em organelas, principalmente a mitocôndria, muitos estudos sobre reparo de DNA têm sido desenvolvidos no intuito de tentar entender melhor o processo de envelhecimento. Isto se deve ao seguinte fato:

(a) Muitos genes de reparo são encontrados no genoma desta organela;

(b) Não se conhece genes de reparo direcionados para organelas, já que estas possuem uma taxa de mutação bem maior do que o genoma nuclear;

(c) Alguns genes que são direcionados para cloroplastos e mitocôndrias já foram clonados por alguns pesquisadores, mostrando a importância destes nestas organelas;

(d) Nada se sabe sobre reparo em organelas.

08 - A doença Xeroderma pigmentoso é caracterizada principalmente por uma maior susceptibilidade ao câncer. Pacintes com esta doença possuem deficiências em:

(a) enzimas do reparo por excisão de bases(BER);

(b) enzimas do reparo por recombinação;

(c) enzimas do reparo por excisão de nucleotídeos(NER);

(d) reparo por excisão de nucleotídeos e transcrição do DNA.

09 - A doença TTD (Tricotiodistrofia) é caracterizada por:

(a) falta de cisteínas nas proteínas;

(b) reparo por recombinação deficiente;

(c) deficiência de reparo e falta de cisteínas nas proteínas;

(d) deficiência de reparo e falta de tirosina nas proteínas.

10 - O câncer HPPC, que é relacionado à deficiência de reparo, é caracterizado por:

(a) mal pareamento de bases do DNA;

(b) Mismatch Repair defeituoso;

(c) Falta de uma enzima importante no reparo por excisão de nucleotídeos;

(d) Deficiência na fotoliase.